2种野外采集白腐真菌分离及其产漆酶液体培养基优化

对照，筛选最佳碳源。

1.2.3.2 氮源筛选。设置硝酸钾、硫酸铵、 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5个氮源处理，以不加氮源为对照，筛选最佳氮源。

1.2.3.3 金属阳离子筛选[6]。设置Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+、Cu2+5个因素，以不加金属阳离子为对照。

1.2.3.4 营养因素正交试验。试验因素与水平见表1。

1.2.3.5 温度的筛选。以营养因素正交试验筛选出来的最佳组合为基础培养基，分别设置15、20、25、30、35、40 ℃共6个不同温度处理。

1.2.3.6 初始pH的筛选。用5% NaOH和0.2 mol/mL HCl将发酵培养基的初始pH分别设置为4、5、6、7、8、9。

1.2.3.7 摇床转速筛选。设置110、140、170、200、230 r/min，以不设转速为对照。

1.2.3.8 培养时间的筛选。根据对2种白腐真菌培养基营养因素及条件的筛选，最后得出最佳培养基配方，并且进行培养，测定1、3、5、7、9、11、13、15 d等不同时间段产漆酶活性。

1.2.4 漆酶活性测定。

1.2.4.1 胞外酶的提取。对液体培养基进行纱布过滤，冰箱冷藏24 h后4 000 r/min离心15 min，上清液即为胞外提取液[12-13]。

1.2.4.2 漆酶活性测定。采用ABTS法。

空白样（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS +1.2 mL去离子水+0.4 mL失活酶液。样品（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS+1.2 mL去离子水+0.4 mL酶液。在40 ℃下应用可见分光光度计检测420 nm波长处吸收值变化，30 s间隔读数，记录240 s内吸收值变化，定义1 min内氧化1 μmol ABTS所需要的酶量为1个漆酶活力单位（U），已知420 nm波长处ABTS摩尔消光系数ε420=3.6×104 L/（mol·cm）。

2 结果与分析

2.1 营养因素对白腐真菌产漆酶的影响

5种碳源中，轮纹韧革菌产漆酶液体培养基中最佳碳源是葡萄糖，其产漆酶最大值为0.578 U/mL；朱红密孔菌产漆酶液体培养基中最佳碳源是麦芽糖，其产漆酶最大值为0.642 U/mL（图1）。

5种氮源中，轮纹韧革菌产漆酶液体培养基中最佳氮源是硝酸钾，其产漆酶最大值为1.069 U/mL；朱红密孔菌产漆酶液体培养基中最佳氮源是酵母膏，其产漆酶最大值为0.752 U/mL（图2）。

2.2 金属阳离子对白腐真菌产漆酶的影响

由图3可知，金属阳离子Mg2+、Cu2+对轮纹韧革菌产漆酶都有促进作用，Cu2+对轮纹韧革菌促进最大，在添加了Cu2+的液体培养基中，其产漆酶最大值为1.349 U/mL。而Ca2+对其有抑制作用，添加了Ca2+的液体培养基产漆酶值为0.389 U/mL，Zn2+、K+影响不大，和不加金属离子产漆酶相差不大。

金属阳离子K+、Mg2+、Cu2+对朱红密孔菌产漆酶都有促进作用，K+对朱红密孔菌促进作用最大，在添加了K+的液体培养基中，其产漆酶最大值为0.931 U/mL。而Ca2+对其有抑制作用，添加了Ca2+的液体培养基产漆酶值为0.056 U/mL，Zn2+对朱红密孔菌产漆酶影响不大。

2.3 不同营养因素正交试验结果

综合评价，轮纹韧革菌液体营养因素培养基最优组合为A2B2C3D1，此时获得的菌丝产漆酶为1.386 U/mL。即优化后的最适培养基为：葡萄糖20.00 g，硝酸钾5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g。由极差R值可知，影响菌丝体产漆酶的因素大小顺序为葡萄糖、硝酸钾、CuSO4和NaH2PO4，葡萄糖和硝酸钾对试验结果有极显著影响（表2）。

朱红密孔菌液体营养因素培养基最优组合为A3B2C1D3，此时获得的菌丝产漆酶为0.940 U/mL。即优化后的最适培养基为：麦芽糖25.00 g，酵母膏5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g。由极差R值可知，影响菌丝体产漆酶的因素大小顺序为麦芽糖、酵母膏、NaH2PO4和KCl，麦芽糖和酵母膏对试验结果有极显著影响（表3）。

2.4 培养条件对白腐真菌产漆酶的影响

2.4.1 pH对白腐真菌产漆酶的影响。

由图4可知，轮纹韧革菌在pH 6的液体培养基中产漆酶量最大，为1.395 U/mL，且偏碱的培养基不适合菌丝体产漆酶。朱红密孔菌产漆酶最适pH为7，产漆酶最大值为0.940 U/mL，偏碱的培养基对其有抑制作用。

2.4.2 温度对白腐真菌产漆酶的影响。

由图5可知，轮纹韧革菌最适温度为25 ℃，产漆酶最大值为1.386 U/mL，朱红密孔菌最适温度为30 ℃，产漆酶最大值为0.972 U/mL。温度过高和过低，2种白腐真菌漆酶活性都降低。

2.4.3 转速对白腐真菌产漆酶的影响。

由图6可知，轮纹韧革菌最佳转速为170 r/min，产漆酶最大值为1.482 U/mL，朱红密孔菌最佳转速为200 r/min，产漆酶最大值为1.117 U/mL，在静置状态下2种白腐真菌产漆酶活性都非常低。

2.5 培养时间对产漆酶的影响 结果表明，轮纹韧革菌在最佳培养基培养下，开始1～5 d漆酶活性较低，在第7天有下降，7～11 d快速增长并且达到最大，在第11天其产漆酶活性为1.557 U/mL，13～15 d漆酶活性稍有下降，并且达到平稳。朱红密孔菌在最佳培养基培养下，开始1～3 d漆酶活性较低，3～7 d平稳增长，并且在7～9 d快速增长，达到最大，在第9天其产漆酶活性为1.478 U/mL，在11 d有下降，11～13 d产漆酶活性变化不大，到15 d又有下降。

3 结论

轮纹韧革菌最佳培养基是葡萄糖20.00 g、硝酸钾5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、温度25 ℃、转速170

r/min，在第11天其产漆酶活性达到最大，为1.557 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.7倍。朱红密孔菌最佳培养基是麦芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、温度30 ℃、转速200 r/min，在第9天其产漆酶活性达到最大，为1.478 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.3倍。通过对2种白腐真菌产漆酶培养基的筛选，得出最佳培养基配方，为后期的漆酶研究提供了理论依据。

参考文献

[1]

程科.白腐菌漆酶分离纯化、酶学性质及其对阿特拉津最适降解条件的研究[D].长春：吉林农业大学，2012.

[2] 刘苹，唐志红，李梦玉，等.金针菇漆酶活性测定的最佳反应条件及液体培养胞外酶的研究[J].食品科技，2012（6）：14-17.

[3] 徐腾飞，卢磊，赵敏，等.一株产漆酶细菌的分离鉴定及酶学性质研究[J].微生物学通报，2013，40（3）：434-442.

[4] 马利.白腐真菌及其漆酶对不同结构染料的降解研究[D].武汉：华中科技大学，2013.

[5] 傅恺.真菌漆酶高产菌株的发酵产酶及酶促降解有机染料的动力学研究[D].广州：華南理工大学，2013.

[6] 张丽.铜离子诱导白腐菌高产漆酶及其用于降解染料的研究[D].广州：华南理工大学，2013.

[7] 王天女，李国富，赵敏，等.重组血红密孔菌漆酶在染料脱色中的应用[J].南京林业大学学报（自然科学版），2016，40（1）：92-96.

[8] 彭丹.黄孢原毛平革菌和黄孢原毛平革菌漆酶对五氯酚降解的研究[D].长沙：湖南大学，2008.

[9] 张博.东北白腐真菌高效产酶及降解多环芳烃特征研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.

[10] 王鼎，曾東方，池汝安，等.3，3′-二甲基联苯胺法测定香菇漆酶活性研究[J].江苏林业科技，2008，35（5）：12-16.

[11] 范寰，廖伟，刘文思，等.白腐真菌液体发酵培养基的优化研究[J].饲料研究，2010（10）：31-33.

[12] 蒋冬冬，李莉，赵新海，等.产漆酶真菌的筛选及其固态发酵条件研究[J].微生物学杂志，2010，30（6）：55-59.

[13] 刘禹，兰进，徐新然，等.灵芝属不同菌种漆酶活性的比较[J].中药材，2016（8）：1692-1695.

推荐访问:培养基 真菌 野外 采集 液体