对照，接种后置于28 ℃恒温培养，3～5 d后观察生长状况。
1.4 生物学特征
按照微生物基本试验方法[5]，进行菌株菌落特征、细胞学特征和液体培养特征观察等。
2 结果与分析
2.1 重金属抗性
由表1可知，Cu2+浓度为0.15 mmol/L时所有菌株均生长很好，Cu2+浓度为0.50和0.90 mmol/L时，除菌株SQ12LD61和SQ12LD68存活外，其他菌株生长良好或很好，在Cu2+浓度为1.20和1.60 mmol/L时，SQ12LD61和SQ12LD68生长受到抑制，其他菌株存活；当Cu2+浓度为1.8 mmol/L时所有菌株均不生长。
由表2可知，所有菌株在Hg2+浓度为0.025 mmol/L时均能很好生长，在Hg2+浓度为0.050 mmol/L的培养基上菌株SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71都生长很好，其余菌株不同程度地受到影响；而在Hg2+浓度为0.075 mmol/L时这4株菌株存活，此浓度为最大抗性浓度。
由表3可知，所有菌株在Cr6+浓度为0.3和0.6 mmol/L的培养基上均生长很好或良好；在Cr6+浓度为1.2 mmol/L时有4株菌株（SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71）能够存活，其他菌株生长均受抑制，此浓度为抗性最大浓度。
由表4可知，在Pb2+浓度为2、3、4 mmol/L梯度下菌株均能生长很好或良好；而Pb2+浓度为5 mmol/L时为菌株抗性的最大浓度，SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71仍存活。重金属抗性结果分析可知，在设定重金属浓度的培养基上，大豆根瘤内生菌对重金属的最大抗性表现为Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.60 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）。另外，重金属低浓度下对菌株没有影响反而促进微生物的生长，高浓度下抑制菌体的正常生长，在一定浓度范围内重金属浓度和菌体生长趋势呈负相关。
2.2 筛选菌株的生物学特性
根据对重金属抗性结果，筛选出4株抗性较强的菌株，即SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71。经固体平板培养、液体培养，测量菌体大小等，生物学特征如表5。由表5可知，4株菌株的平板菌落特征均为湿润、（半）透明、液体培养均产生絮状沉淀并产生气泡，革兰氏染色SQ12LD42呈紫色，为革兰氏阳性菌，其余3株为革兰氏阴性菌。根据以上特征和依据《细菌分类手册》与《伯杰氏细菌手册》，初步判定4株菌株均为豆科植物根瘤内生细菌特征。
3 小结
筛选的4株菌均来源于努鲁尔山北麓的内蒙古敖汉旗段，对重金属均表现出较强抗性，这些抗性与采集地大豆的生长环境密切相关。内蒙古敖汉旗地下蕴藏着丰富的矿产资源，如铁、金、铜、钨、铅、石灰石等，长期的自然选择筛选出抗性强的菌株。而商丘市地处豫东平原，属黄淮流域，地势平坦，土壤多为沙壤土，除人为工业重金属污染外没有天然的重金属污染矿区。徐亚军等[6]研究表明，根瘤菌与豆科植物形成共生固氮体系，它的地理分布受到地形、土壤结构、气候及宿主植物分布等影响。而内生菌和根瘤菌共处于根瘤微环境，它们与宿主植物形成了稳定的互惠互利关系，共同抵御外界不良环境的胁迫，提高了内生菌的抗逆性，可能也是内生菌抗重金属的一个原因。
本试验通过平板富集、群体效应进行，结果表明，菌株对不同重金属浓度的抗性不同，低浓度促进菌体的生长，高浓度抑制菌体的生长。由于在低浓度下，这些重金属离子是微生物生长所需的营养要素，如生物体中的某些酶是以Cu作为辅基，Cr与细胞膜稳定性、核酸结构以及生物体的正常代谢有关[7]。筛选出的4株菌能够同时耐受多种重金属，可能是通过分泌质子氨基酸以及各种有机酸，提高体系的酸度，溶解重金属，或者利用代谢产物与重金属配合改变形态[8]。有研究表明，快生型大豆根瘤菌在代谢过程中能分泌有机酸和各种氨基酸等代谢产物。
由于重金属毒害使敏感菌丧失而耐受菌富集[9]，这使得微生物群落对环境胁迫的适应能力增强[10]。本试验74株菌中，菌株对Pb2+的最大抗性浓度为5 mmol/L，对Cu2+的最大抗性浓度为1.60 mmol/L；对Hg2+的抗性最小，浓度为0.075 mmol/L。可见，菌株对不同重金属间的抗性存在差异。抗性差异除了与菌株本身遗传因素有关外，还与寄主植物的生态条件密切相关。这可能是由于根瘤内生菌与相应寄主植物对特殊环境长期相适应的结果[11]。缪福俊等[12]对会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌耐铅锌研究结果，王金华等[13]对兰坪铅锌尾矿区植物根瘤菌对重金属等因子的抗性研究，均支持了本研究结果。但对于每种重金属的具体抗性机制以及抗性菌株的系统发育地位正在进一步的研究。
参考文献：
[1] 邱并生.根瘤内生细菌[J].微生物学通报，2013，40（3）：544.
[2] 陈明丽.浅谈植物内生细菌的作用机制及生物学作用[J].现代化农业，2012（7）：68-69.
[3] 赵 旭，常思静，景春娥，等.我国植物内生菌研究进展[J].中国沙漠，2010，30（1）：87-91.
[4] 陈文新，汪恩涛，陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系[J].中国农业科学，2004，37（1）：81-86.
[5] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2004.
[6] 徐亚军，赵龙飞，徐国学.努鲁尔虎山东部北麓敖汉旗段豆科植物根瘤菌资源调查[J].湖北农业科学，2013，52（12）：2749-2752.
[7] 梁建强，段晓丹，崔广玲，等.西北地区金属尾矿地根瘤菌的重金属抗性及其系统发育研究[J].农业环境科学学报，2009，28（6）：1120-1126.
[8] GUO X J， HUANG Q Y， CHEN W L， et al. Effect of microorganisms on the mobility of heavy metals in soil environments[J].China Appl Environ Biol， 2001， 8（1）： 105-110.
[9] 王发园.土壤重金属污染对微生物多样性的影响[J].安徽农业科学，2008，36（18）：7817-7828.
[10] 曹 莹，马 宁，常佳丽，等.西北部分矿区豆科植物根瘤菌重金属抗性及16S rDNA RFLP分析[J].农业环境科学报，2010， 29（6）：1156-1163.
[11] 徐开未，张小平，陈远学，等.攀枝花市相思树根瘤菌抗逆性的研究[J].北方园艺，2009（6）：165-168.
[12] 缪福俊，熊 智，李 彪，等.会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的耐铅锌16S rDNA PCR-RFLP研究[J].西北农业学报，2011， 20（11）：89-93.
[13] 王金华，刘绍雄，朱丽丽，等.兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的多样性及抗性研究[J].生态环境学报，2012，21（4）：744-749.
（责任编辑 韩 雪）