对照，测定培养15 d后发酵上清液的还原糖。
1.2.5 产酶菌株的初步鉴定 采用菌体直接扩增16S rDNA的方法[11]。PCR扩增引物选用16S rDNA细菌通用引物27f/1492r（上游引物5′-AGAGTTTG ACCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-TACCTTGTTACG ACTT-3′）。反应体系：25 mmol/L MgCl2 5 μL，10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL（浓度2 μmol/L），模板DNA 1 μL，Taq酶 （5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 12.25 μL，总体系为25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，共30个循环。PCR产物采用试剂盒（Axyprep DNA Gel Extraction K it Axygen Biosciences）纯化后送至深圳华大基因科技有限公司进行测序，将测序结果同GenBank数据库的基因序列进行比对，以确定该菌类型。
2 结果与分析
2.1 产酶菌株的筛选
将富集培养的细菌经过梯度稀释后接种到筛选培养基上，筛选出7株可以产透明圈的菌株分别命名为1、2、3、4、5、6、7。测定7株菌的菌落直径以及透明圈直径和菌落直径比，结果如表1所示，1号菌的透明圈与菌落直径比较大。在几丁质平板上，菌落周围形成的透明圈除与菌株产酶水平相关外，还与菌株分泌的几丁质内切酶与外切酶比例相关，所以不能仅以菌落周围透明圈大小判断菌株的产酶能力，筛选时必须综合考虑透明圈大小、明亮程度、菌落大小以及菌落下培养基的液化程度[12]。因此，对所选取的7株含有透明圈的菌株进行复筛，从中选出目的菌株。
2.2 酶活测定
2.2.1 标准曲线制作 测定不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）的吸光度，绘制标准曲线如图1所示。从标准曲线可以看出，NAG的含量和吸光度呈线性关系，回归方程为y=1.936 9x-0.040 0，R2=0.993 8，式中，x为葡萄糖含量（μg/mL），y为OD540。
2.2.2 发酵液粗酶活 对挑选的7株含有透明圈的菌株放入发酵培养基中培养，取上清液，利用标准曲线的测定方法测定吸光值，通过计算得到的酶活如图2所示。由表1、图2可以看出，4号菌株的透明圈与菌落直径比较2、5、6号菌株透明圈与菌落直径比大，而其酶活却较之小，由此可知，透明圈与菌落直径比与酶活力的高低并非呈正相关。通过酶活的测定得到1号菌株的吸光值最大，表明在相同时间内，该菌株产生的酶活最大。因此选用1号菌株作为目的菌株。
2.3 酶学性质测定
2.3.1 pH对酶活性质的影响 将1号菌株放在不同pH梯度下，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度。所测结果如图3所示，随着pH升高，酶活力不断升高，在pH 7.5以后开始下降。在pH 7.5～8.0时酶的活性较高，在pH 7.5时最高，所以该酶最适pH为7.5。该酶在pH<5时几乎没有活性，在pH>7.5活性开始下降，pH为10时仍有较高的活性，说明该菌耐碱性能力较强，在中性和碱性条件下更容易产生几丁质酶。
2.3.2 温度对酶活的影响 将pH固定在最适pH 7.5，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度，绘制不同温度下的酶活曲线。结果如图4所示，该酶在20～60 ℃时活性非常高，但在30 ℃时最高，所以该酶最适温度为30 ℃。该酶60 ℃活力下降很快，在70 ℃以后活力极小。该几丁质酶的最适反应温度为30 ℃，略高于蜂房芽孢杆菌产生的酶，低于黄杆菌产生的酶，据报道蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度为28 ℃[3]，黄杆菌的最适酶活温度为50 ℃[2]。
2.3.3 酶的pH稳定性 酶液在不同pH缓冲液中4 ℃保存12 h后，测得残余酶活，绘制相对酶活曲线（图5）。由图5可知，pH 6.5～9.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下非常稳定。
2.3.4 酶的热稳定性 在最适pH条件下，通过标准曲线的测定方法，测定不同温度下保存30 min后的酶活，绘制不同温度下的相对酶活曲线（图6）。由图6可知，该酶在低于60 ℃的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 ℃处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。
2.4 产酶菌株的初步鉴定
将16S rDNA的测序结果通过Blast软件与GenBank数据库比对，发现该序列与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）同源性最高，达到100%，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。
2.5 菌株降解蟹壳的能力
取1 mL发酵液上清液与DNS反应，根据标准曲线计算得出，每瓶发酵液总还原糖为5.3 mg，即该菌降解1 g蟹壳产生5.3 mg还原糖。表明该菌株可以直接降解蟹壳，但降解效果不是很好。
3 小结与讨论
通过平板透明圈法初筛、复筛，从土壤中获得一株透明圈最大的1号菌株，根据菌株和菌落的形态以及革兰氏染色，初步鉴定该菌株为紫色短杆菌，经过16S rDNA的测序，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。
本试验中所研究的细菌产几丁质酶的最适pH为7.5，略高于蜂房芽孢杆菌和黄杆菌，蜂房芽孢杆菌产的酶的最适pH为6.8[9]，黄杆菌产的酶的最适pH为7.0[2]。该几丁质酶的最适反应温度为30 ℃，略高于蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度28 ℃[9]，而低于黄杆菌的最适酶活温度50 ℃[2]。
酶是一种活性蛋白，因此酶的稳定性在研究酶的过程中起重要作用，而温度和pH是影响酶稳定性的两个主要因素。本研究中，几丁质酶在pH 6.5～9.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下非常稳定；同时该酶在低于60 ℃的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 ℃处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。众所周知，蟹壳中几丁质的含量很高，但是目前未见有利用菌直接降解蟹壳的报道。本研究首次将筛选的菌直接用于降解蟹壳，结果表明，该菌具有降解蟹壳的能力，但是效果不是很好。原因可能是蟹壳没有经过任何处理，结构紧密不适合直接降解，或者培养条件不合适，没有达到最佳降解条件，还有待于进一步的研究。
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