摘要： 采用大葱/黄瓜轮作和黄瓜/黄瓜连作两种栽培模式，比较研究了黄瓜根际土壤微生物多样性的差异，在此基础上，进一步探讨了大葱根系分泌物对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响。结果表明：与连作相比，大葱轮作提高了黄瓜根际土壤中细菌、放线菌的多样性及均匀度指数，降低了真菌的多样性与均匀度指数；大葱根系分泌物处理可提高黄瓜根际土壤中细菌和真菌的多样性和均匀度指数，但对放线菌的作用不明显；较高浓度的大葱根系分泌物可引起黄瓜根际土壤中部分细菌和真菌聚集。
关键词：大葱；轮作；根系分泌物；微生物多样性；PCR-DGGE
中图分类号：S154.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0072-07
AbstractThe differences of microbial diversity in rhizosphere soil of cucumber in greenhouse were studied under welsh onion-cucumber rotation and continuous cucumber cropping modes. On this basis， the influences of welsh onion root exudates on soil microbial diversity were further discussed. The results showed that， compared with continuous cropping， welsh onion rotation increased the diversity and evenness indexes of bacteria and actinomyces and reduced those of fungi in cucumber rhizosphere soil. The welsh onion root exudates treatment could increase the diversity and evenness indexes of bacteria and fungi in cucumber rhizosphere soil， but the effect on actinomyces was not obvious. High levels of welsh onion root exudates could cause aggregation of some bacteria and fungi in cucumber rhizosphere soil.
Key wordsWelsh onion； Rotation； Root exudates； Microbial diversity； PCR-DGGE
连作障碍严重制约设施蔬菜高产高效与可持续发展。连作会引起土壤微生物结构变化，细菌和放线菌种类与数量减少，有害微生物种类与数量增加[1]，根际微生物平衡遭到破坏，微生物种群多样性降低[2]。合理轮、间（套）作是减轻或克服土壤连作障碍的有效措施[3]，能够增加细菌和放线菌等有益微生物的种类与数量，提高土壤微生物多样性，改善土壤生态环境，促进作物生长[2～4]。
土壤中微生物种类很多，但采用传统方法只能培养其中0.1%～10%的微生物[5]，不能完全反映土壤中微生物群落的状况。PCR-DGGE作为一种现代分子生物学研究手段，能够较好地从DNA水平上反映微生物群落的变化及其多样性，弥补了传统微生物培养方法的缺陷[6]。
黄瓜是设施主栽蔬菜，对连作反应敏感[7]。各作物与黄瓜轮作的研究发现，大葱/黄瓜轮作对连作土壤的改良作用及对黄瓜生育的影响更为明显[8]。研究表明，大葱轮作可显著改善黄瓜连作土壤的理化和生物学特性，增加细菌和放线菌数量，减少真菌数量，抑制枯萎病病原菌繁殖，促进生长，提高产量[9，10]，但其内在机制尚未完全明确。
为此，本试验采用PCR-DGGE技术，比较研究了大葱/黄瓜轮作和黄瓜/黄瓜连作条件下根际土壤微生物多样性的变化，并进一步探讨了大葱根系分泌物对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响，旨在从一个侧面揭示大葱轮作缓解黄瓜连作障害的原因，为制定合理栽培制度提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试材料
供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。土壤类型为棕壤，土壤理化性状为pH 6.19，EC 825 μS/cm，碱解氮238.0 mg/kg，有效磷151.2 mg/kg，速效钾131.2 mg/kg。
供试黄瓜（Cucumis sativus L.）品种‘新津11号’，大葱（Allium fistulosum L.）品种‘元藏大葱’。Amberlite XAD-4吸附树脂购于Sigma公司。
1.2 试验设计及处理
1.2.1轮作和连作对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响试验于2011年8月至2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理：大葱/黄瓜轮作（T），黄瓜/黄瓜连作（CK）。每处理10盆，重复3次，随机排放。花盆直径30 cm，高25 cm，内装连作土壤10 kg。黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株。后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，于5月15日、5月25日、6月5日取土样。
1.2.2大葱根系分泌物处理对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响用连续根系分泌物收集系统（Continuous Root Exudates Trapping System，CRETS）收集大葱根系分泌物[11]。按占新华等[12]方法测定溶液中总有机碳浓度，并用去离子水配制总有机碳浓度105、210、420 mg/L的大葱根系分泌物溶液，置4℃冰箱中备用。
试验于2012年11月至2013年1月在山东农业大学北校区玻璃温室进行。将催芽的黄瓜种播于装280 g风干连作土的塑料钵（8 cm×8 cm）中，自幼苗子叶展平开始，采用上述浓度的大葱根系分泌物溶液，以等量去离子水作对照（CK）进行处理，每盆均匀浇灌50 mL，每2天处理一次，视天气情况补浇同等量的水。重复3次，每重复4株，完全随机排列。从初次灌溉处理起，共30天。处理完后的第3天取土样。
1.3测定项目与方法
1.3.1根际土壤采集按雷娟利等[13]方法获取根际土样，混匀，放-70℃冰箱保存，进行微生物群落结构PCR-DGGE测定。
3讨论
土壤微生物在植物残体降解、养分转化循环等过程中扮演重要角色[16]，影响植物生长的根际土壤微生态环境。土壤微生物群落结构会影响植株生长发育[17]，提高微生物多样性，有效改善土壤微生态环境，促进作物生长，提高产量[2]。本试验结果表明，与连作相比，大葱轮作可明显改善黄瓜根际微生物群落结构，提高细菌与放线菌群落的多样性和均匀度指数，降低真菌群落多样性和均匀度指数。吴凤芝等[2]研究也发现，与连作相比，轮作更有利于提高黄瓜土壤微生物多样性和稳定性。改善作物根际土壤的微生物环境为其正常生长和提高产量奠定了基础。
根系分泌物是影响土壤微生物的重要因子之一[18]。不同栽培制度造成土壤微生物数量及种群结构的变异，与作物残体和根系分泌物在土壤中的积累有关[19]。本试验中，与对照相比，大葱根系分泌物处理改变了黄瓜根际土壤的微生物群落结构，显著提高了细菌和真菌群落的多样性及均匀度指数，进而提高了土壤中微生物多样性，与前人研究结果相似[19]。但大葱根系分泌物处理和大葱轮作的效果存在着差异，可能与两种条件下实际进入土壤中的根系分泌物成分及含量不同有关。不同作物根系分泌物成分及含量存在差异，对土壤微生物的影响也不同。赵大君等[20]发现，凤眼莲根系分泌物的氨基酸组成对根际细菌趋化作用产生明显的影响。Zhou等[21]发现，对羟基苯甲酸可降低细菌群落的Shannon-Weaver指数及均匀度指数，但提高真菌群落的Shannon-Weaver指数及均匀度指数。也有研究发现，根系分泌物中的糖、氨基酸等种类和含量与病原菌孢子萌发及菌丝生长有关[22]。大葱根系分泌物处理和大葱轮作对黄瓜根际微生物群落结构的影响差异原因值得进一步探讨。
参考文献：
[1]徐瑞富， 任永信. 连作花生田土壤微生物群落动态与减产因素分析[J].农业系统科学与综合研究， 2003， 19（1）：33-34， 38.
[2]吴凤芝， 王学征. 设施黄瓜连作和轮作中土壤微生物群落多样性的变化及其与产量品质的关系[J]. 中国农业科学， 2007， 40（10）：2274-2280.
[3]张学军， 陈晓群， 王黎民， 等.设施蔬菜连作障碍原因与防治措施研究[J].科学技术与工程， 2003， 3（6）：590-593.
[4]吴凤芝， 王学征， 潘凯.小麦和大豆茬口对黄瓜土壤微生物生态特征的影响[J].应用生态学报， 2008， 19（4）：794-798.
[5]Amann R I， Luswig W， Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Review， 1995， 59（1）： 143-169.
[6]张宝涛， 王立群， 伍宁丰， 等. PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用[J].生物信息学， 2006， 4（3）：132-134， 142.
[7]刘松涛， 李辉， 李茜. 设施蔬菜连作障碍的研究进展[J].安徽农学通报， 2013， 19（1/2）：56-58.
[8]吴焕涛. 轮作和休茬对日光温室连作土壤性状及黄瓜生育的影响[D]. 泰安：山东农业大学， 2008.
[9]李元， 司力珊， 张雪艳， 等. 填闲作物对日光温室土壤环境作用效果比较研究[J].农业工程学报， 2008， 24（1）：224-229.
[10]吴焕涛， 魏珉， 杨凤娟， 等. 轮作和休茬对日光温室黄瓜连作土壤的改良效果[J]. 山东农业科学， 2008（5）：59-63.
[11]Tang C S， Young C C. Collection and identification of allelopathic compounds from the undisturbed root system of bigalta limpograss（Hemarthria altissima） [J]. Plant Physiology， 1982， 69（1）：155-160.
[12]占新华，周立祥. 土壤溶液和水体中水溶性有机碳的比色测定[J].中国环境科学， 2002， 22（5）：433-437.
[13]雷娟利， 寿伟松， 董文其， 等. 抗感枯萎病西瓜根际微生物比较研究[J]. 微生物学通报， 2008， 35（7）：1034-1038.
[14]Xu Y， Wang G， Jin J， et al. Bacterial communities in soybean rhizosphere in response to soil type， soybean genotype， and their growth stage [J]. Soil Biol. Bioehem.，2009，41（5）：919-925.
[15]胡元森， 吴坤， 刘娜， 等.黄瓜不同生育期根际微生物区系变化研究[J].中国农业科学， 2004， 37（10）：1521-1526.
[16]Kennydy A C， Smith K L. Soil microbial diversity index and the sustainability of agricultural soils[J]. Plant and Soil， 1995， 170（1）：75-86.
[17]Batten K M， Scow K M， Espeland E K. Soil microbial community associated with an invasive grass differen-tially impacts native plant performance[J]. Microb. Ecol.， 2008， 55（2）： 220-228.
[18]Broekling C D， Broz A K， Bergelson J， et al. Root exudates regulate soil fungal community composition and diversity[J].Appl. Environ. Microbiol.， 2008，74（3）：738-744.
[19]王岩， 沈其荣， 史瑞和， 等.土壤微生物量及其生态效应[J].南京农业大学学报， 1996， 19（4）：45-51.
[20]赵大君，郑师章.凤眼莲根分泌物氨基酸组分对根际肠杆菌属F2细菌的趋化作用[J].应用生态学报， 1996，7（2）：207-212.
[21]Zhou X G， Yu G B， Wu F Z. Responses of soil microbial communities in the rhizosphere of cucumber （Cucumis sativus L.） to exogenously applied p-hydroxybenzoic acid[J]. Journal of Chemical Ecology， 2012， 38（8）：975-983.
[22]刘素萍， 王汝贤， 张荣， 等. 根系分泌物中糖和氨基酸对棉花枯萎菌的影响[J].西北农业大学学报， 1998， 26（6）：30-35.