摘要[目的]进一步了解博落回生物碱的抑菌作用范围。[方法]采用牛津杯法和琼脂打孔法研究博落回生物总碱对4种植物病原细菌和8种植物病原真菌的抑制效应。[结果]博落回生物总碱在浓度为1.00 mg/ml时，对水稻白叶枯病菌、大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌和姜瘟病菌均具有较好的抑制活性（抑菌圈直径大于30 mm），对8种植物病原真菌也表现出较好的抑制活性，其中对棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌和苹果腐烂病菌效果明显，抑菌圈直径达16 mm以上。对细菌的最低抑菌浓度（MIC）为31.25～62.50 μg/ml，对真菌的MIC为125.00～250.00 μg/ml。[结论]博落回生物总碱具有作为抗菌剂应用的潜力。
关键词博落回；总生物碱；植物病原菌；抑菌活性
中图分类号S482.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05810-03
博落回（Macleaya cordata）为罂粟科博落回属多年生草本植物，全株可入药，民间用于止咳、治疗疥癣、疗毒及杀虫灭蛆等。博落回主要含血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、博落回碱等多种异喹啉类生物碱成分，具有抗菌、杀虫、抗肿瘤、改善肝脏功能等多种生物活性[1]。在抗菌作用方面，已有研究报道了博落回提取物或分离生物碱成分对感染人体的常见病原细菌及真菌具有不同程度的抑制作用[2-4]，对曲霉、青霉、根霉、毛霉等常见真菌也有较好的抑制作用[5]。此外，还有研究表明博落回对导致鱼病及畜禽感染的病原细菌也具有抑制效应[6-7]。
博落回对农作物病原菌的抑制效应已有少量报道，如刘浩等[8-12]采用不同方法研究了博落回提取物或分离成分对多种植物病原真菌的抑制作用，但对植物病原细菌的抑制作用研究极少[8-9]。为进一步了解博落回生物碱的抑菌作用范围，笔者研究了博落回生物总碱对4种植物病原细菌和8种植物病原真菌的离体抑制活性，以期为博落回生物碱的进一步研究及应用开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种。细菌：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora）、柑橘溃疡病菌（Xanthomonas campestris）、姜瘟病菌（Pseudomonas solanacarum）。 真菌：小麦赤霉病菌 （Fusarium graminearum）、油菜菌核病菌 （Sclerotinia sclerotiorum）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）、番茄绵腐病菌（Pythium aphanidermatum）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers）、苹果腐烂病菌（Valsa mali Miyabe et Yamade）和葡萄黑痘病菌[Elsinoe ampelina （de Bary） Shear]。上述供试细菌及真菌均由四川大学农药与作物保护研究所提供。
1.1.2供试药剂。博落回生物总碱由湖南汉清生物技术有限公司提供，主要含血根碱和白屈菜红碱，总生物碱含量大于80%。
1.2方法
1.2.1供试药液的配制。
1.2.1.1博落回生物总碱供试液。博落回生物总碱粉末用1%氢氧化钠溶解，按倍数稀释法配制成浓度为1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25和15.63 μg/ml的供试液，置于4 ℃冰箱备用。
1.2.1.2青霉素钠溶液。将青霉素钠用20%甲醇溶解配成500 μg/ml的母液，按倍数稀释法配成浓度为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/ml的供试液，置于4 ℃冰箱备用。
1.2.2菌种活化。
1.2.2.1细菌活化。采用液体牛肉膏蛋白胨培养基[13]。将冰箱保存的细菌菌种分别接1环于灭菌的液体蛋白胨牛肉膏培养基中，37 ℃恒温振荡培养箱内培养18～24 h。
1.2.2.2真菌活化。采用PDA液体培养基[13]。将冰箱保存的真菌菌种分别接种真菌菌饼（直径6 mm）于灭菌的液体PDA培养基中，28 ℃恒温振荡培养箱内培养18～24 h。
1.2.3细菌抑制活性测定。
1.2.3.1抑菌圈直径的测定。采用牛津杯法。倒好琼脂平板后，冷却，吸取0.2 ml 供试细菌菌悬液，均匀涂满整个平板，静置5 min后每板等距放入5个牛津杯，轻轻加压使牛津杯和培养基无缝隙。3个牛津杯中加入0.2 ml博落回生物总碱供试液（浓度为1.00 mg/ml），其余2个牛津杯中分别加入等量的2%甲醇溶液和0.50 mg/ml 青霉素钠溶液，分别作为阴性对照和阳性对照。每一菌种3次重复。于37 ℃培养48 h后测定抑菌圈直径。
1.2.3.2最低抑菌浓度（MIC）的测定。采用琼脂打孔法。吸取1 ml细菌菌悬液于培养皿中，加入24.0 ml 牛肉膏蛋白胨培养基（45～50 ℃），使菌液与培养基充分混匀，静置冷却。用直径6 mm的打孔器打孔，分别加入博落回生物总碱的不同浓度供试液100 μl。于37 ℃培养48 h后观察抑菌情况，以抑菌圈直径≥7 mm的供试液最低浓度作为MIC。青霉素钠阳性对照采用相同方法测定其MIC。
1.2.4真菌抑制活性测定。
1.2.4.1抑菌圈直径的测定。采用牛津杯法。倒好平板并冷却后，吸取0.2 ml 供试真菌菌悬液均匀涂布整个平板，静置5 min后每板等距放入3个牛津杯，轻轻加压使牛津杯和培养基无缝隙。每个牛津杯加入0.2 ml博落回生物总碱供试液（浓度为1.00 mg/ml）。每一菌种3次重复。于28 ℃培养48 h后测定抑菌圈大小。
1.2.4.2MIC的测定。采用琼脂打孔法。吸取1 ml真菌菌悬液于PDA培养皿中，加入24.0 ml 培养基（45～50 ℃），使菌液与培养基充分混匀，静置冷却。用直径6 mm的打孔器打孔，分别加入博落回生物总碱的不同浓度供试液100 μl。于28 ℃培养48 h后观察抑菌情况，以抑菌圈直径≥7 mm的供试液最低浓度作为MIC。
1.2.5数据处理。抑菌圈直径采用Excel软件计算平均值及标准误。显著性差异分析采用DPS7.5软件，按最小显著差异法（LSD）进行多重比较。
2结果与分析
2.1博落回生物总碱对4种植物病原细菌的抑制效应由表1可知，在浓度为1.00 mg/ml时，博落回生物总碱对水稻白叶枯病菌、大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌及姜瘟病菌的抑菌圈直径均超过30 mm，但在4个植物病原细菌间无显著差异。青霉素钠阳性对照对水稻白叶枯病菌的抑制效果最好，其次为姜瘟病菌，而对大白菜软腐病菌和柑橘溃疡病菌的抑制效果相对较弱。
最低抑菌浓度测定结果表明（表2），博落回生物总碱对水稻白叶枯病菌和姜瘟病菌的抑制效果较好，MIC均为3125 μg/ml，对大白菜软腐病菌和柑橘溃疡病菌的MIC为6250 μg/ml。青霉素钠阳性对照对水稻白叶枯病菌、大白菜软腐病菌和姜瘟病菌的MIC为12.50 μg/ml，对柑橘溃疡病菌的MIC为25.00 μg/ml。
3讨论
试验结果表明，博落回生物总碱对水稻白叶枯病菌、大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌和姜瘟病菌具有较好的抑制作用，供试液浓度在1.00 mg/ml时抑菌圈直径均在30 mm以上；MIC测定结果（31.25～62.50 μg/ml）也表明博落回生物总碱具有较好的抑制效应。刘浩等采用博落回全株酸水提取物进行抑菌活性测定，发现在50.00 mg/ml浓度时对黄瓜细菌性角斑病菌和辣椒疮痂病菌的抑菌圈直径分别为11.3和12.3 mm[9]，他们进一步研究发现，主要是博落回生物碱中的血根碱及白屈菜红碱发挥了抑菌作用（MIC为16.00～32.00 μg/ml）[8]。虽然到目前为止，有关博落回对植物病原细菌抑制效应的研究报道较少，但该研究结果进一步表明博落回可能在抑制植物病原细菌方面具有较大潜力。
博落回生物总碱对真菌的抑菌效果也较好，在1.00 mg/ml浓度时抑菌圈直径为12.8～17.5 mm，特别是对棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌和苹果腐烂病菌的抑制效应更明显，抑菌圈直径均大于16 mm。对应MIC测定结果与抑菌圈直径大小，除苹果腐烂病菌和小麦赤霉病菌外，其余结果在二者间均基本吻合。胡美忠等研究了博落回生物总碱对烟草黑胫病菌的抑制效应，发现在320.00 μg/ml浓度时的抑制率为77.4%[11]。胡乔木等采用菌丝生长速率法研究发现博落回粗提物对小麦赤霉病菌的抑制率超过80%[12]。刘浩等研究表明，博落回全株酸水提取物在2.00 mg/ml浓度时对棉花枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻纹枯病菌和禾谷丝核菌的抑制率为70.0%～80.0%[9]。还有研究发现博落回地上部水提液对大葱紫斑病菌也有较好的抑制效果（抑制率为68.3%）[10]。此外，对博落回提取物中的分离成分如血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱等进行抑制真菌活性研究，也发现对轮纹病菌、葡萄灰霉病菌、禾谷镰刀病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌及烟草黑胫病菌等具有较好的抑制效应[8，11]。
该研究所采用的8个菌种中，除棉花枯萎病菌和小麦赤霉病菌外，其余6个菌种均未见有应用于博落回抑菌效应的研究。该研究结果表明，博落回在抑制真菌方面可能具有较大的作用范围，值得进行深入研究和应用开发。
参考文献
[1] 刘浩，谈满良，单体江，等.博落回生物碱与生物活性及其应用[J].中国野生植物资源，2009，28（3）：21-23.
[2] KOSINA P，GREGOROVA J，GRUZ J，et al.Phytochemical and antimicrobial characterization of Macleaya cordata herb[J].Fitoterapia，2010，81（8）：1006-1012.
[3] 田晶，郁建平，葛永辉，等.博落回中生物碱对5种皮癣真菌抑制作用的初步研究[J].中成药，2010，32（7）：1108-1111.
[4] 赵东亮，郁建平，周晓秋，等.博落回生物碱的抑菌作用研究[J].食品科学，2005，26（1）：45-47.
[5] 郁建平，赵东亮，孟祥斌，等.博落回生物碱对八种真菌的抑菌作用研究[J].贵州大学学报：自然科学版，2006，23（1）：77-80.
[6] 王高学，王建福，原居林，等.博落回杀灭鱼类指环虫和病原菌活性成分的研究[J].西北植物学报，2007，27（8）：1650-1655.
[7] 郁建生.博落回制剂对禽霍乱、仔猪白痢的对比治疗试验[J].黑龙江畜牧兽医，2007（2）：91-93.
[8] LIU H，WANG J，ZHAO J，et al.Isoquinoline alkaloids from Macleaya cordata active against plant microbial pathogens[J].Nat Prod Commun，2009，4（11）：1557-1560.
[9] 刘浩，谈满良，周立刚，等.博落回、虎杖和黄芩提取物对植物病原菌的抑制作用[J].天然产物研究与开发，2009，21（3）：400-403.
[10] 陈利军，尹健，熊建伟，等.7种药用植物提取物抑菌活性测定[J].安徽农业科学，2006，34（21）：5562.
[11] 胡美忠，郁建平，郁建生.博落回生物碱对烟草黑胫病的抑制作用[J].黑龙江畜牧兽医，2010（6）：137-139.
[12] 胡乔木，王玮，仰晓莉，等.核桃楸和博落回粗提物对不同植物病原真菌的抑制作用研究[J].湖北植保，2006（2）：31-32.
[13] 张玲.微生物学实验指导[M].北京：北京交通大学出版社，2007.