设计含有一千多个氨基酸的TALEN蛋白，该过程耗时耗力，还可能引起未知的机体免疫反应，降低TALEN在细胞中的作用；另外，目前TALEN还不能很好地解决高效识别目的基因的问题，而这正是基因敲除中的重要环节。
规律成簇的间隔短回文重复序列系统
规律成簇的间隔短回文重复序列系统是第三代人工核酸酶，该系统最初在原核生物中被发现，它使生物具有某种获得性免疫功能，从而具备抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。直到2013年，该系统才被改造成为一种新型的基因组编辑技术，该系统凭借其独特的优势迅速成为全球生物医学领域的新宠。
CRISPR系统一般由两部分构成：CRISPR基因座转录的RNA以及CRISPR-associated（Cas）蛋白，其中II型CRISPR系统即CRISPR/Cas9系统被广泛应用于基因组编辑。与ZFN和TALEN不同，在CRISPR系统中CRISPR基因座负责特异性识别DNA，而Cas9核酸酶则具有与ZFP和TALE蛋白相似的功能，即切割DNA片段，使DNA发生双链断裂进而诱导细胞产生DNA损伤修复。目前，CRISPR/Cas9已经在斑马鱼、大鼠、小鼠、猴以及人类细胞等成功实现基因的靶向修饰。
CRISPR/Cas9系统相比于ZFN和TALEN有着明显的优势：由于CRISPR/Cas9系统是通过碱基互补配对进行基因的定位，因此与ZFN和TALEN相比，它在基因组中搜索的范围更广；CRISPR/Cas9系统可同时设计多个基因识别序列，可以完成ZFN和TALEN不能实施的对多个基因同时定点修饰的功能：CRISPR/Cas9系统在构建方面比ZFN和TALEN更简易且成本较低；CRISPR/Cas9系统易于改造，以实现更多生物学功能。然而，与ZFN、TALEN这些人工核酸酶一样，CRISPR/Cas9系统也存在不能高效识别目的基因的问题。
基因组编辑技术的应用
基因功能研究
随着高通量测序技术的快速发展，科学家迫切希望对基因功能进行更加深入的研究，其中将目的基因敲除是基因功能研究中不可缺少的环节。随着ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统的发展，许多物种实现了单个或者多个靶基因的敲除，极大地推动了基因功能的研究。例如，利用ZFN技术在大鼠上成功实现靶基因的敲除，并证实该基因突变可稳定遗传至下一代；运用TALEN技术对斑马鱼的Tnikb和Dip2a两基因进行定点突变，随后证明这种突变可稳定遗传：利用CRISPR/Cas9系统同时编辑5个不同基因，使得深入研究基因家族成员的功能相关性成为可能。
基因治疗
基因治疗是将表达异常的致病基因利用基因编辑技术，将其改造为正常基因，实现治疗疾病的目的。传统基因治疗方法不仅很难将细胞中的缺陷基因的精准替换为正常基因，而且可能会将外源遗传信息遗留在细胞内，对细胞产生不可预知的作用。而人工核酸酶技术则可以在靶位点对基因实施精确的编辑或敲除，实现基因治疗的目的。
ZFN和TALEN作为最先发展的人工核酸酶技术，在基因治疗方面有着广泛的应用。利用ZFN技术在敲除小鼠突变的血友病基因后，再利用病毒载体将正常基因导入小鼠体内，从而实现血友病的治疗。此外，利用传统的基因编辑技术很难实现对线粒体遗传信息的改造。而将TALEN技术成功应用于线粒体突变基因的敲除，则使得治疗由线粒体DNA突变引起的疾病成为可能。
CRISPR/Cas9系统作为第三代人工核酸酶技术，被广泛应用于疾病的基因治疗。胡文辉等运用CRISPR/Cas9技术首次将艾滋病病毒从人细胞中清除，这对于艾滋病的治愈有着重要意义；尹浩等利用CRISPR/Cas9技术修饰了可导致酪氨酸血症I型的基因，成功纠正了部分存在于肝细胞中的突变基因，将正常肝细胞恢复至总量的三分之一，这足以治愈该病，
人类疾病模型
在人类疾病发病机制和药物筛选研究中，构建人类疾病动物模型有着不可替代的重要作用。灵长类动物是生物医学研究中广泛使用的实验动物，由于其在生理生化和遗传上与人类高度接近，成为研究人类疾病适宜的动物模型。
2014年，笔者所在研究组与合作者利用TALEN技术实现了对食蟹猴x染色体连锁基因MECP2基因的敲除，首次成功构建非人灵长类动物模型。MECP2基因位于x染色体，该基因的突变通常会造成雄性胎儿在妊娠中期发生死亡，而雌性胎儿则可顺利出生并存活，该胎儿在出生后6-18个月发生病变，表现出自闭症特点的“Rett综合征（Rett syndrome）”，这是一种严重影响女性神经系统发育的疾病。
同年，笔者与合作者又利用CRISPR/Cas9技术对食蟹猴基因组进行修饰，获得多位点基因敲除的双胞胎食蟹猴，这是CRISPR/Cas9技术首次应用于非人灵长类，对于一些由多基因控制的神经退行性疾病的研究（例如帕金森病）和相关疾病动物模型的构建有着非常重要的意义。通过进一步检测新生小猴脐带和胎盘的DNA样本，没有发现脱靶现象。此外，对流产胎儿的生殖系细胞利用单细胞测序技术进行检测后，发现生殖细胞也发生了基因突变，首次证明运用CRISPR/Cas9技术介导的基因突变可以实现生殖系遗传。
挑战与展望
传统的基因打靶技术在人类疾病动物模型建立和发展新的基因治疗手段中，发挥着重要的作用，而人工核酸酶介导的基因编辑技术凭借独特优势，更是极大地推动了生命科学研究的进程，其中利用CRISPR/Cas9构建的灵长类动物模型对于研究人类疾病具有里程碑式的意义。但即使是TALEN，CRISPR/Cas9这些能精确进行基因修饰的人工核酸酶技术也处于发展的初级阶段，很多问题有待解决，如怎样提高打靶效率获得纯合的基因编辑子代，外源基因的定点敲入等。此外。体细胞核移植技术是获得转基因动物最为可靠和有效的方法，在未来的研究中将人工核酸酶技术与核移植技术结合，可以更高效地建立人类疾病的动物模型，为深入研究疾病发病机制和探索新的治疗方案提供更多可能。