利用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析和Sephacryl 凝胶柱层析对灰树花（Grifola frondosa）子实体水提醇沉粗多糖进行分离纯化，对分离纯化到的一种多糖GFP75-2-2B进行了分析。紫外光谱鉴定结果表明，GFP75-2-2B不含蛋白质、核酸和酚类成分；离子色谱分析表明其单糖组成为岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，摩尔比为1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5。GFP75-2-2B对巨噬细胞株RAW264.7进行体外免疫活性的研究结果表明，GFP75-2-2B有明显刺激巨噬细胞分泌NO的活性。
灰树花； 多糖； 分离纯化； 巨噬细胞； NO
灰树花（Grifola frondosa）是担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌属中的一种大型珍稀食药用真菌，具有显著的抗癌、保肝、降血压、提高免疫力等诸多药理活性[1～4]。目前，已有多种以灰树花为原料的保健品和药品上市销售，如保健品保利生胶囊、Maiext、Grifron和药品麦特消。笔者从灰树花子实体中分离纯化得到一种小分子量多糖GFP75-2-2B，运用紫外扫描、离子色谱等方法对该化合物的结构进行初步鉴定，并研究了其在体外刺激巨噬细胞RAW264.7分泌NO的活性，以期为灰树花多糖的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
灰树花（G. frondosa）子实体购于浙江方格药业有限公司。标本存放于上海市农业科学院食用菌研究所药用真菌研究室。RAW264.7巨噬细胞株购于中科院细胞所。
1.2试剂
细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为Sigma公司产品；青霉素、链霉素为Amresco公司产品；DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）为Gibco公司产品；DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-400和Sephacryl S-100填料为GE 公司产品。其它试剂均为国产分析纯。
1.3体外刺激RAW264.7释放NO试验
1.3.1RAW264.7巨噬细胞的培养
用DMEM完全培养基在37 ℃、含5%CO2条件下传代培养后，用0.05％胰酶溶液消化，混悬液于1 500 g离心3 min，收集细胞，用无色RPMI-1640培养基将细胞稀释至106个/mL备用[5]。
1.3.2巨噬细胞释放NO产量的测定
在无菌条件下将样品用PBS（含0.14 mol/L NaCl, 0.0027 mol/L KCl, 0.004 mol/L Na2HPO4, 0.002 mol/L KH2PO4, pH 7.4）溶解并稀释成不同浓度的溶液。将细胞悬液加入96孔板，每孔180 μL，然后加入20 μL待测样品，每个样品设置3个复孔，以LPS (1 μg/mL) 为阳性对照，PBS为阴性对照，37 ℃，5% CO2条件下培养24 h，按文献[5]的方法测定巨噬细胞释放NO的产量。
1.4GFP75-2-2B的分离纯化
称取1 kg灰树花子实体于30 L蒸馏水中浸泡1 h后100 ℃提取2 h，过滤，滤渣重复上述操作2次，合并提取液，加热浓缩至2 L，向浓缩液中加无水乙醇至醇浓度50%，静置过夜，取上清，向上清中继续加无水乙醇至浓度为75%，静置过夜，3 450 g离心20 min，收集沉淀，水浴挥去乙醇，冷冻干燥后得粗多糖，命名为GFP75。将GFP75上阴离子交换柱和凝胶柱层析，按1.3中的方法测定各分离组分的体外免疫活性，选择活性好的组分之一进行下一步分离，最终得GFP75-2-2B（图1）。
阴离子交换柱层析：用蒸馏水将GFP75配制成30 mg/mL的溶液，18 000 g离心20 min，取40 mL上清液，Amersham Bioscience的KTA prime 层析系统进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析（26 mm×100 cm），用0～2 mol/L的NaCl梯度洗脱，流速4 mL/min，15 mL/管分部收集，苯酚-硫酸法[6]检测糖峰，合并收集主峰，减压浓缩，脱盐，冷冻干燥。
凝胶柱层析：用蒸馏水将GFP75-2配成10 mg/mL溶液，Amersham Bioscience的FPLC层析系统进行Sephacryl S-400凝胶柱层析（26 mm×100 cm），用蒸馏水洗脱，流速1 mL/min，10 mL/管分部收集，RID-10A示差折光检测器检测，合并收集第三、第四主峰（GFP75-2-2），浓缩至15 mL，取1 mL进行Sephacryl S-100凝胶柱层析（16 mm×100 cm）。合并收集第二个单峰，减压浓缩后冷冻干燥得GFP75-2-2B，GFP75-2-2B再经Sephacryl S-100凝胶柱进行纯度检验。
1.5GFP75-2-2B紫外光谱鉴定
用蒸馏水将GFP75-2-2B配成1 mg/mL溶液，在200～400 nm处进行紫外扫描（Synergy HT 多功能酶标仪，Bio-Tek公司）。
1.6单糖组成分析
称取2 mg GFP75-2-2B样品，加入3 mL 2 mol/L的三氟乙酸，于110 ℃水解3 h后，转入锲形瓶中，于旋转蒸发仪上（40 ℃）减压蒸干，再加3 mL甲醇减压浓缩挥尽残留的三氟乙酸，用1 mL去离子水溶解后进行离子色谱分析（Dionex ICS 2500，Dionex公司）。以标准单糖为参考，分离柱：保护柱CarboPacTMPA20（3 mm×30 mm），分析柱CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm）；脉冲安培检测器检测，流动相为 A相：去离子水，B相：0.25 mol/L NaOH,C相 ：1 mol/L NaAc；流速0.45 mL/min，洗脱程序与工作参数见参考文献[7]。
2 结果分析
2.1GFP75-2-2B的分离纯化
GFP75-2-2经Sephacryl S-100 柱层析后得到两个完全分离的对称峰，第二峰GFP75-2-2B再次经Sephacryl S-100柱层析检测为一对称单峰（图2），该单峰位于150 mL处，在Sephacryl S-100的有效分离范围内，表明GFP75-2-2B为相对均匀的小分子量组分 (<8 000 Da)。
2.2紫外光谱鉴定结果
200～400 nm处进行紫外扫描，结果显示，在280 nm和254 nm附近无明显特征吸收峰，说明不含蛋白质和核酸，也不含酚类成分。
2.3单糖组成
离子色谱分析结果表明， GFP75-2-2B主要由岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，其摩尔比为1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5。
2.4体外刺激RAW264.7巨噬细胞分泌NO的试验结果
将GFP75-2和GFP75-2-2B用PBS配成0.2、0.5、1.0 mg/mL的溶液（作用细胞的终浓度为20、50、100 μg/mL）进行体外刺激巨噬细胞分泌NO的实验，结果表明 GFP75-2-2B具有明显的促进巨噬细胞株RAW264.7分泌NO的能力，在低浓度20 μg/mL时就表现出良好的刺激作用，并且随着GFP75-2-2B浓度的增加刺激作用逐渐升高，当浓度为50 μg/mL和阳性对照LPS活性相当（图3），与相同浓度的GFP75-2溶液相比，GFP75-2-2B的免疫活性显著增强。
PBS:磷酸缓冲液为阴性对照；LPS：细菌脂多糖为阳性对照
PBS：phosplate buffer, negative control; LPS: lipopolysaccharide, positive control
图3 GFP75-2-2B刺激RAW264.7巨噬细胞分泌NO的活性
Fig.3 Effect of GFP75-2-2B on NO release from RAW264.7 cells
3 讨论
灰树花子实体中含有蛋白质、核酸、多糖等多种活性成分，本研究利用热水提取乙醇分级沉淀的方法去除了灰树花子实体中的小分子物质和部分核酸、蛋白质等大分子物质，经离子交换柱和凝胶柱层析得到组分相对均匀的灰树花多糖GFP75-2-2B并对其结构和活性进行了初步研究，分离过程中得到的其它组分将另文报道。
在免疫系统中，巨噬细胞通过吞噬侵入体内的有害物质、提呈抗原和分泌细胞因子等途径发挥防御和调节功能。NO的分泌能够增强巨噬细胞对病原微生物、肿瘤细胞等有害物质的作用，是巨噬细胞活化的主要特征之一。有研究表明，多糖的免疫调节作用和活化巨噬细胞有密切联系[8] 。本研究中，灰树花多糖GFP75-2-2B能够促进巨噬细胞株RAW264.7分泌NO，在低浓度时就表现出良好的刺激作用，可见活化巨噬细胞是灰树花多糖发挥免疫调节作用的途径之一。
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Isolation and Purification of GFP75-2-2B, a
Polysaccharide from Grifola frondosa Fruit Bodies, and
its Effect on Nitric Oxide Release from Macrophages
QIAO Yau1,2, LUO Yonghuang1, ZHOU Shuai2, YANG Yan2, JIA Wei2,
TANG Qingjiu2, LIU Yanfang2, ZHANG Jingsong2, ZHOU Changyan2*
1College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716; 2National Engineering Research
Center of Edible Fungi; Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization, Ministry of Agriculture;
Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai; Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy
of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China
A water-soluble, crude polysaccharide preparation was obtained from Grifola frondosa fruit bodies by hot water (100 ℃) extraction followed by ethanol (75%) precipitation. A purified polysaccharide, GFP75-2-2B, was obtained from the crude material by successive fractionation using DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography and Sephacryl S gel filtration chromatography. UV spectroscopy detected no protein or nucleic acid in GFP75-2-2B, which consisted of fucose, rhamnose, galactose, glucose and mannose in the molecular ratios of 1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5. GFP75-2-2B significantly enhanced the release of NO from RAW264.7 macrophages.
Grifola frondosa； polysaccharide; isolation and purification； macrophage; NO