材料与方法
1.1 材料
小麦秸秆和枯烂树叶分别取自河南孟州和江苏连云港的农家或农田，均为露天自然堆放1年以上。木聚糖、木糖、葡萄糖、结晶纤维素和其他主要化学试剂等购自国药集团化学试剂有限公司；麸皮在当地市场购买。
1.2 培养基
用于筛选细菌的培养基为肉汤培养基：牛肉膏 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 5 g/L， pH 7.0～7.2。
用于筛选真菌的培养基为查氏培养基：KNO3 3 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。
用于筛选酵母的培养基为YPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，自然pH。
分离筛选培养基：1 mol/L NaOH预处理的小麦秸秆10 g/L，琼脂15 g/L。
发酵培养基：1 mol/L NaOH预处理的小麦秸秆20 g/L、蛋白胨5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L，自然pH。
1.3 秸秆降解菌的分离
在采集的小麦秸秆和树叶等样品中加入无菌水振荡，取适量涂布于秸秆分离筛选琼脂平板。挑取单菌落至培养基平板上划线纯化分离3次，得到纯菌种。将菌种转至相应液体摇瓶培养基，于第0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5天分别测定小麦秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的降解率以及木聚糖酶、纤维素酶的酶活。
1.4 菌种鉴定
直接观察菌株在PDA平板上的生长变化；从平板上挑菌体少许，涂于载玻片上，置于显微镜下观察。
分子鉴定：提取真菌的基因组DNA，采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCT GCCG-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]扩增菌株整个ITS序列（内部转录间隔区）序列，PCR产物经胶回收纯化、过PCR柱纯化，与pGEM-T连接后，转化到E.coli JM109中，培养至对数生长期，提取质粒并纯化后提交生工生物工程（上海）股份有限公司。测序结果经DNAMAN软件去载体后，将所得的ITS rDNA序列提交到GenBank数据库，利用Blastn工具进行序列比对，对菌株进行鉴定。应用Clustal X（Version 1.83）软件进行同源性分析，用Treeview（Version 3.2）软件构建进化树。
1.5 酶活测定
小麦秸秆发酵液经5 400 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液。CMC酶活力的测定参考文献[11]。
纤维素酶活公式：
X为纤维素酶活（U/mL）；W为葡萄糖生成量（mg）；V为反应液中酶液加入量；5.56为1 mg的葡萄糖的微摩尔数（1 000/180=5.56）；N为样品稀释倍数；T为反应时间。
木聚糖酶活力测定参考文献[11]。木聚糖酶活公式：
X为木聚糖酶（U/mL）；W为木糖生成量（mg）；V为反应液中酶液加入量；5.56为1 mg的木聚糖的微摩尔数（1 000/150=6.67）；N为样品稀释倍数；T为反应时间。
采用Van Soest法测定纤维素、半纤维素与木质素含量，按照文献[12]方法，并略加改动：即①用18%H2SO4代替37%浓盐酸配制地衣酚试剂；②用3%SDS代替Van Soest方法配制的中性洗涤剂。
1.6 还原糖含量的测定
在试管中加入1 mL上清液（可适当稀释），3.0 mL DNS试剂，将待测样品放入沸水浴中反应5 min，用水定容至25 mL，空白管以1 mL水代替1 mL酶液，然后以空白管较零，在540 nm下测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量[13]。
1.7 红外扫描样品
定时取出发酵液5 400 r/min离心10 min，所获得的残渣在50 ℃下烘干至恒重，然后取约4 mg残渣于研钵中，并加少量的KBr，研磨充分，进行压片[14]。
1.8 数据分析
采用SPSS10.0软件进行数据处理，每处理3次重复。
2 结果与分析
2.1 降解小麦秸秆菌株的筛选
从采集的小麦秸秆样本中筛选出具有一定秸秆降解能力的菌株29株，经摇瓶培养测定对比各菌株降解纤维素、半纤维素及木质素的能力，最终确定菌株ZH-19降解秸秆能力最高，对小麦秸秆中的纤维素和半纤维素降解率分别达到87.91%±5.24%和66.54%±7.56%。
2.2 菌株ZH-19的鉴定
如图1所示，菌株ZH-19的菌落在PDA培养基上培养7 d，直径约50 mm，中间有脐状突起而其他部分平坦；质地绒状；分生孢子大量产生；菌落中心呈灰绿色，菌落反面为黄褐色。
以菌株ZH-19基因组DNA为模板，采用通用引物ITS1和ITS4扩增整个ITS序列，PCR产物经纯化后插入pGEM-T载体中，对扩增产物进行测序。将序列提交到Genebank数据库，数据库登记号为DQ532125。将其ITS基因序列在Genebank数据库进行同源性比对，与其相似性较高序列的系统发育树如图2所示，从相似性分析和系统进化树可以看出，Penicillium thiersii NRRL 28147与菌株ZH-19的ITS序列的相似性达100%，表明二者亲缘性最近。因此，综合形态鉴定和分子鉴定，将菌株ZH-19命名为Penicillium thiersii ZH-19。
2.3 P. thiersii ZH-19降解小麦秸秆
2.3.1 纤维素酶、半纤维素酶和还原糖的变化 从图3可知，从发酵开始到第4.5天，小麦秸秆还原糖浓度逐渐下降，到第4.5天降到最小值，为165.33 μg/mL，之后还原糖浓度先上升后下降，直到第9天后趋于平稳，还原糖浓度不再变化。1.5 d之前菌体密度较低，对培养基原有还原糖消耗较低，且种子培养基内带有部分纤维素酶和木聚糖酶，将秸杆分解为还原糖。随着培养过程的发展，菌体生长加快，消耗糖较大，因此还原糖浓度逐渐下降至最低；从第4.5天开始，由于菌体消耗的糖和产生的还原糖维持平衡，还原糖的浓度保持不变。
0～7.5 d培养期间，P. thiersii ZH-19菌株所产生的纤维素酶和木聚糖酶活性总体上均处于上升阶段。其中，纤维素酶活性在培养第6天时达到最大，为145.54 U/mL；而木聚糖酶在第7.5天时达到最大，为93.54 U/mL，之后二者活性均呈逐渐降低的趋势。结果表明，在前6 d培养过程中，P. thiersii ZH-19菌株处于有利于菌体生长、酶表达和分泌的有利条件，第7.5天后，由于营养物质的消耗、pH变化等因素影响，导致菌体生长以及酶活保持能力均有一定程度的下降。
2.3.2 纤维素和半纤维素含量的变化 由图4可知，小麦秸杆中纤维素含量明显高于半纤维素含量。随着发酵天数的增加，纤维素和半纤维素含量呈降低的趋势；第7.5天，二者含量下降至6.57%±0.53%、1.72%±0.72%。之后，纤维素和半纤维素的含量变化不明显。从图4中也可看出，纤维素含量下降的速率要明显快于半纤维素，由此可推测P. thiersii ZH-19菌株优先降解纤维素。这也与其产纤维素酶和半纤维素酶活变化情况一致。
2.3.3 P. thiersii ZH-19降解小麦秸秆后样品的FT-IR分析 图5为第0、6、10.5天P. thiersii ZH-19菌株降解小麦秸秆的FT-IR图谱。由图5可知，随着发酵天数的增加，3 328 cm-1左右，2 358 cm-1左右、1 432～1 593 cm-1、1 318 cm-1和989～1 112 cm-1的相对峰值增强以及谱峰向低波数方向移动，表明小麦秸杆中碳水化合物（纤维素和半纤维素）在逐步分解，大分子的长链烃切断成小分子的短链烃，木质纤维素中的环状结构逐渐被裂解成为链状化合物，从而使羟基、亚甲基基团及羧基数量不断增加，再次证实了P. thiersii可降解秸杆中纤维素和半纤维素。
3 小结
从自然环境中筛选出1株可同时分泌纤维素酶和木聚糖酶的菌株，通过形态学分析和ITS保守区进行测序，该菌株被鉴定为Penicillium thiersii ZH-19，其序列在GenBank上登记号为DQ235784。通过酶活测定、秸秆中纤维素和半纤维素含量测定以及FT-IR分析发现，筛选的P. thiersii ZH-19在降解小麦秸秆过程中，纤维素优先被降解，同时，该降解过程可能由纤维素酶、半纤维素酶协同作用下实现对木质纤维素的最大降解。今后将进一步优化培养条件和培养基组分，提高酶活性，克隆相关的功能基因，深入研究其酶学性质，为开发新型纤维素酶和木聚糖酶制剂奠定基础。
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