【摘要】 目的：探讨miR-34b基因表达及其启动子区甲基化（MSP）在甲状腺乳头状癌（PTC）中的临床意义。方法：收集2008年10月-2013年1月本院治疗的42例甲状腺乳头状癌患者癌组织标本（实验组）和42例甲状腺腺瘤患者瘤旁组织标本（对照组），检测两组miR-34bmRNA表达（实时定量PCR法）及miR-34b基因启动子区甲基化（甲基化特异性PCR法），并对结果进行分析。结果：实验组miR-34b mRNA相对平均表达量（0.84±0.04），miR-34b基因启动子甲基化阳性率71.4%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组中不同性别、年龄、肿瘤直径、分期和包膜浸润之间，甲基化阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）；而存在淋巴结转移甲基化率（88.5%）显著高于不存在淋巴结转移（43.8%），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-34b基因表达及其启动子区甲基化与PTC发生发展具有密切关系，建议临床深入研究。
【关键词】 甲状腺乳头状癌； miR-34b基因； 甲基化
甲状腺癌为头颈部最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈明显增加趋势。乳头状癌其中分化较好的病理类型，约占甲状腺癌的70%，以女性多见[1-2]。甲状腺癌的发生发展涉及多种基因的突变和重组，但其具体发病机制尚不明确。miR-34b基因作为重要调控因子之一，在甲状腺癌变过程中具有关键作用[3]。本文分析甲状腺乳头状癌（PTC）miR-34b基因表达及其启动子区甲基化，旨在发现特异性分子标志物，为甲状腺乳头状癌的早期发现及治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集本院2008年10月-2013年1月手术切除治疗的42例PTC患者的癌组织（实验组）和42例甲状腺腺瘤患者瘤旁组织（对照组），实验组中男18例，女24例；年龄25～74岁，平均（48.6±6.2）岁，≤50岁22例，50岁以上20例；肿瘤直径≤2 cm共19例，肿瘤直径>2 cm共23例；TNM分期结果：Ⅰ期20例，Ⅱ期7例，Ⅲ期12例，Ⅳ期3例；发生包膜浸润14例，未发生包膜浸润28例；存在淋巴结转移26例，无淋巴结转移16例。对照组中男17例，女25例；年龄24～73岁，平均（48.3±6.4）岁，≤50岁21例，50岁以上21例；所有标本均经组织病理学检查明确诊断，所有标本在离体10 min内完成取材，置于液氮内放入-80 ℃冰箱内进行保存。本实验患者均签署知情同意书。
1.2 实验方法
1.2.1 实验试剂及仪器 美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂盒及ABI 7900HT PCR仪，日本TAK-ARA公司生产的逆转录试剂盒，上海吉玛公司生产RT-PCR试剂盒，由上海英骏生物工程公司所合成的PCR引物序列，美国 ZYMO RESEARCH生物科技公司销售的EZ DNA MethylationTM -GOLD Kit试剂盒。美国赛默飞世尔科技公司生产的Forma88000超低温冰箱，德国艾本德公司生产的Centrifuge 5810R高速离心机，Powerpac HC电泳仪（美国 BIO-RAD公司），美国Thermo公司制造的NANODROP 1000紫外分光光度计，凝胶成像仪及凝胶数字成像系统（美国UVP公司）。
1.2.2 提取组织RNA 液氮研磨法：研磨新鲜组织成粉末状，滴加Trizol试剂进行混合，参照Trizol试剂盒说明书对组织总RNA进行提取。成功提取后用紫外分光光度计（光密度值260/280）对RNA纯度进行检测，总RNA在1.8～2.0 之间，保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.2.3 检测miR-34b mRNA表达 RT-PCR 法：参照miRNAs RT-PCR试剂盒以及逆转录试剂盒中所附说明书进行操作，cDNA通过试剂盒内的通用逆转录引物进行合成。反应体系：Primer、脱氧核糖核苷三磷酸Mixture及RNA 均为1 μL，dd H2O为7 μL；反应条件：42 ℃中作用60 min后72 ℃中作用10 min。以cDNA为模板扩增PCR ，反应体系：10.0 μL PCR Mix，0.4 μL miR-34b引物，2.0 μL c DNA，0.2 μL Taq DNA多聚酶，7.4 μL dd H2O；反应条件：95 ℃内3 min预变性；95 ℃中作用12 s，60 ℃中作用60 s，共循环40次。内参照为β-肌动蛋白mRNA。
1.2.4 检测甲基化特异性 PCR法检测：酚氯仿抽提法提取MSP组织DNA。EZ DNA MethylationTM -GOLD Kit试剂盒修饰及纯化甲基化基因组DNA。甲基化条件：15 min 95 ℃， 30 s 95 ℃，30 s 54 ℃，40 s 72 ℃，循环35次；非甲基化条件：15 min 95 ℃，30 s 95 ℃，30 s 58 ℃，40 s 72 ℃，循环35次。紫外线下观察分析PCR凝胶电泳情况（1%琼脂糖）。甲基化引物序列片段长度为128 bp，上游5-ATTCGTTTCGTTTCGCGTTCGTTTC-3，下游5-CTAAAACTAACTCTCTCGACCCCG-3。
1.3 观察指标 参照文献[4]应用2-△△CT法计算miR-34b mRNA的相对平均表达量，分析甲基化与临床病理的关系。
1.4 统计学处理 应用SPSS 14.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用非配对t检验，组内比较采用配对t检验，计数资料采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-34b mRNA表达结果 miR-34b mRNA相对平均表达量结果为实验组（0.84±0.04），对照组（1.63±0.07），两组比较差异有统计学意义（t=6.354，P=0.021），提示miR-34bmRNA在PTC组织中相对表达量显著低于甲状腺腺瘤瘤旁组织。
2.2 miR-34b基因启动子甲基化结果 MSP产物电泳甲基化阳性为同时扩增显现U及M条带，甲基化阴性为只扩增U条带（详见图1及图2）。观察组甲基化阳性率为71.4%（30/42），对照组甲基化阳性率为40.5%（17/42），两组比较差异有统计学意义（ 字2=8.163， P=0.004）。
2.3 实验组miR-34b基因启动子甲基化与临床病理的关系 经统计分析，患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期以及是否存在包膜浸润对miR-34b基因启动子甲基化结果均无显著影响，甲基化阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）；而在是否伴有淋巴结转移方面，miR-34b基因启动子甲基化阳性率差异有统计学意义（P<0.05），即有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者。见表1。
3 讨论
甲状腺乳头状癌是临床高发的内分泌系统恶性肿瘤之一，严重威胁患者生命健康。甲状腺乳头状癌的发生发展是多因素、多基因共同作用的结果，单纯依据肿瘤细胞病理组织形态难以进行准确诊断和分型[5-6]。随着分子生物学的发展，癌基因及编码蛋白的异常表达逐渐被证实与肿瘤形成具有密切关系。由高等真核生物基因组编码的miRNA成熟后，保守性、时序性和组织特异性较高，对基因表达和形成肿瘤起重要作用[7]。肿瘤细胞中最常见的分子改变就是甲基化，目前多项研究证实基因组甲基化和基因启动子区甲基化与肿瘤相关基因异常转录均有关，是肿瘤发生发展的重要因素之一[8-11]。本实验结果显示，miR-34b在PTC癌组织的表达量以及甲基化阳性率显著高于甲状腺腺瘤瘤旁组织（P<0.05），miR-34b启动子区甲基化与淋巴结转移关系密切，淋巴转转移者甲基化阳性率显著高于无淋巴结转移者（P<0.05），提示miR-34b对PTC的形成具有重要作用，miR-34b甲基化水平对判断PTC转移情况有重要意义，癌组织中miR-34b mRNA表达量虽低，但甲基化水平却高达71.4%，可能是癌组织中 miR-34b基因启动子存在甲基化异常。miR-34b是miR-34家族成员之一，作为p53信号通路的重要组成部分，miR-34基因表达情况与p53状态关系密切，研究证实p53的直接靶点就是miR-34基因[4]，而p53是DNA损伤及致瘤效应有效介导作用，miR-34基因异常表达将直接影响细胞凋亡及细胞周期，调控细胞增殖。研究发现甲状腺乳头状癌基因甲基化（包括p53相关区域、E钙黏素基因等），能够引发转录异常，基因启动子区甲基化异常促使miRNA基因丧失活性，从而调控p53通路，干预细胞生长过程，影响导致PTC发生发展[11-12]。miR-34b基因及其启动子区甲基化，引发DNA转录异常，促进癌细胞增殖，加速肿瘤细胞转移，抑制促凋亡作用，最终导致PTC发生及恶化。综上所述，miR-34b基因及其启动子区甲基化与PTC关系密切，有望成为PTC诊断及预后的分子生物学参考指标。
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（收稿日期：2014-02-07）（本文编辑：陈丹云）