[摘要] 目的 探寻阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD） 患者尿液中潜在的生物标志物，为AD的早期诊断提供依据。 方法 通过超高效液相色谱-质谱联用和代谢组学的方法，考查AD患者和正常老年人尿液中代谢产物的扰动。对于超高效液相色谱-质谱联用所产生的色谱图，进行主成分分析显示出疾病组和正常组之间的代谢物的变化。 结果 AD患者的鞘氨醇类、色氨酸相对于正常组变化明显，发现7个潜在的与AD相关的生物标志物。 结论 AD患者的代谢物谱发生了明显改变，可以为AD的诊断提供依据。
[关键词] 阿尔茨海默病；代谢组学；生物标志物
[中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0007-03
阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病。65岁以上的老年人口中AD的发病率为5%～10%，而80岁以上的老年人口中其发病率高达50%[1]。目前尚不能对AD行早期诊断，更无有效的治疗措施， AD的防治是一项国际性的难题。代谢组学是研究外源性物质对生物体产生的整体效应，并以生物体内物质分子的整体作为对象， 通过核磁共振（NMR）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段，定性或定量研究生物体液中的代谢产物，研究药物对机体所形成代谢组的系统作用[2-3]。本研究采用代谢助学的方法，确定AD的潜在生物标志物。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液相系统Waters AcquityTM Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） system，购自美国Waters公司；质谱仪Micromass Quattro microTM API三重四级杆质谱仪，购自美国Waters 公司；高效液相-飞行时间质谱联用仪（HPLC-ESI-QTOF- MS），购自德国Bruker公司；台式离心机（TGL-16C），购自海安亭科学仪器厂；高速台式冷冻离心机（TGL-16），购自湘仪离心机仪器有限公司；振荡器CAY-1型液体快速混合器，购自北京长安仪器厂；微量取样器（200 μL）Proline单道可调移液器，购自上海科华实验系统有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），购自美国 Fisher公司。
1.2 实验对象
本研究选取中国医科大学附属盛京医院AD患者（阿尔茨海默病组）和健康的老年志愿者（对照组），各20例，两组一般情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。本研究遵照《赫尔辛基宣言》的原则实施。健康老年受试者没有神经和认知疾病。
1.3 实验方法
1.3.1 尿样采集与预处理 采集20例AD患者和20例健康老年志愿者晨尿，约10 mL，加叠氮化钠作为防腐剂，3500 r/min离心10 min。取上清液至于-20 ℃的冰箱中，待用。
1.3.2 图谱采集 取200 μL尿样加入1.5 mL EP管中，加入400 μL甲醇沉淀蛋白，在4 ℃的低温离心机中，15 000 r/min离心10 min，上清液转移至另一EP管中，保持30℃恒温，在N2气流下吹干，用100 μL甲醇复溶，复溶后转移至2 mL的进样瓶中，进样10 μL，用于UPLC-MS分析。
1.3.3 数据分析 通过Masslynx software （version 4.0）系统中的Markerlynx软件进行原始数据的分析，包括峰检测和校准，测定每个峰的保留时间和质荷比（m/z）数。由这些数据得到每个色谱图上的总离子强度数据。运用Markerlynx软件进行主成分分析，主要参数设置如下：质谱的质量数误差为0.01 Da，噪音消除水平为10.0，初始和结束保留时间为别为0和 16 min，低、高分子量分别设置成100、1000 amu。
1.3.4 生物标志物的鉴定 从全扫描质谱图中分析生物标志物并且作图。由碰撞诱导的裂解（CID）方式可以得到这些潜在生物标志物的裂解谱图。一些标志物与标准物质对比色谱峰保留时间和二级质谱碎片特征。这些代谢物的全扫描质谱图，通过查找可利用的生物化学数据库，例如KEGG、METLIN等得到解释。同时，一些生物标志物通过在相同液相条件下，对比在Bruker飞行时间质谱（ESI-QTOF-MS）上的保留时间和精确分子量来确认。
2 结果
2.1 UPLC/MS代谢产物的图谱
阿尔茨海默病组和对照组尿样总离子流（TIC）色谱图。见图1。
2.2 UPLC/MS数据分析
将原始图谱导入Markerlynx软件进行主成分分析，得到代谢组学研究所需要的数据表。阿尔茨海默病组和对照组的得分图（图2）中两组基本分离，两组的边界比较清晰， 且无明显的交叉和重叠。该结果提示所建立的方法能找到潜在的生物标志物，并且把大多数AD患者与健康老年人区分开来。
2.3 生物标志物的确认
AD患者尿液的代谢组学中，生物标志物的鉴定结果见表2。在正离子模式下，保留时间（min）和质核比（Rt_m/z）成对出现，分别为0.5_145.9、8.2_246.3、9.4_274.3、10.7_302.3、9.5_318.3、12.0 _330.4、10.8_346.4共7种化合物。保留时间是0.49，质荷比为145.8的标志物通过与标准品对比保留时间、质荷比和子离子扫描碎片被鉴定为色氨酸片段。通过在Waters UPLC/MS/MS仪器上分析分子量和裂解碎片之后，进一步分析了来自Bruker"s ESI-QTOF-MS 分析的精确分子量数据和二级裂解碎片，通过比较两者的一致性，查找HMDB和KEGG数据库，这一类化合物被鉴定为鞘氨醇类似物，分别为246.3：C14 DHS，274.3：C16 DHS，302.3：C18 DHS，318.3：C18 PHS，330.4：C20 DHS，346.4：C20 PHS。这些标志物在AD患者尿液的含量明显低于对照组。
3 讨论
AD是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认等方面的障碍。在美国，该病每年至少造成10万人死亡，仅次于心脏病、癌症、脑卒中。AD是老年人，尤其是高龄老人的常见病。65岁以上的老年人口中AD的发病率为5%～10%，而80岁以上的老年人口中其发病率高达50%。据国际老年痴呆协会（ADI）的统计，全世界目前有2400多万人正在遭受AD的折磨，并且以每7秒新增1例患者的速度递增。随着人民生活水平的日益提高，在不久的将来我国将进入老龄社会。预计我国2015年老年人口将超过2亿，21世纪40年代后期可能突破4亿。在我国，这是一群沉默的患者，中国政府和公众对AD的认知程度，比美国晚几十年。目前我国AD患病数至少达600万，是世界上患病人数最多的国家。目前尚不能对AD行早期诊断，更无有效的治疗措施，因此，其被称为“2l世纪病”。AD的防治是一项国际性的难题[4]，已经引起了世界各国政府与医学界的高度关注。AD属于一种多基因或多因素疾病，有关该病发病机制存在众多学说，包括淀粉瀑布样学说、中枢胆碱能低下学说、钙稳态失调学说和慢性炎症反应学说等，但其确切病因和发病机制尚不清楚，因而，临床缺乏有效的诊疗措施。
2009年美国华盛顿大学Clayton取得了神经退行性疾病代谢组学研究的新进展，关于脂类代谢轮廓作为神经退行性疾病的早期诊断生物标志物申请了美国专利。该项研究表明，20多种脂类，近千个脂类化合物，可以用来作为神经退行性疾病的早期诊断的代谢标志物。本研究选择了尿液作为代谢组学研究的样本，临床取材方便，对患者损伤小。结果表明，AD患者尿液中确定的7个生物标志物，6个为神经鞘氨醇类化合物。神经鞘脂类被认为是重要的信号分子，介导了许多生物学功能，例如，细胞生长、分化、老化和程序性死亡[5]。神经鞘脂类的代谢产物神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸-鞘氨醇在控制细胞程序性凋亡中，起着重要的作用[6]。更为重要的是，神经酰胺为在细胞因子、抗原、抗癌药物或者环境应激诱导物引起的程序死亡的潜在内源性调节剂。此外，给予外源性的神经酰胺类似物，能模拟细胞的程序性死亡。研究表明，给大鼠食用神经酰胺或者其衍生物，对于大鼠在认知、学习、记忆方面的脑部功能均有有利的作用[7]。含有神经鞘脂类、神经酰胺类的食物和医药制剂可能用于预防和治疗AD，而没有任何副作用。研究表明，烟曲霉毒素是对于神经鞘氨醇N-酰基转移酶（神经酰胺合成酶）很有效的抑制剂，而这个酶是神经鞘酯类生物合成中的关键酶[8]。神经酰胺合成酶的抑制能导致组织、尿液中神经酰胺的含量增加。由于病理的环境，使得神经酰胺合成酶的活性增强，造成作为神经酰胺合成底物的鞘氨醇类含量降低，由此鞘氨醇类物质的变化可作为AD的生物标志物。
本研究表明，色氨酸在AD患者中的含量降低。色氨酸是人体内重要的必需氨基酸，对于合成蛋白质和维持机体内环境的稳定有重要作用。大多数色氨酸在哺乳动物经犬尿氨酸途径代谢[9]，即在吲哚胺-2，3-双加氧酶的作用下色氨酸被催化成甲酰犬尿氨酸，进一步生成尿喹啉酸。喹啉酸可以保护中枢神经系统避免受到兴奋性氨基酸的损伤。部分色氨酸经色氨酸羟化酶生成5-羟色胺酸，进一步脱羧生成5-羟色胺[10]。5-羟色胺是重要的神经递质，其与中枢神经系统功能异常有关。AD患者犬尿氨酸代谢途径紊乱，外周血液中被发现色氨酸的分解增加，其代谢产物喹啉酸可以导致活性氧的形成增加，造成中枢神经系统细胞的损伤。因此，色氨酸及其代谢物对于AD的诊断有重要作用[11]。
综上所述，本实验成功地将代谢组学应用于AD的研究，发现了几个潜在的能区别AD患者和正常者的生物标志物，对于AD的临床诊断和治疗有重要意义。
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（收稿日期：2013-01-24 本文编辑：程 铭）