黄花蒿品种（品系）群体遗传结构及遗传多样性的SCoT分析

材料间内在的遗传结构，尤其对反映杂交亲本间亲和性以及选配的参考作用有限。因此，本文采新型的目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子标记技术^[9]分析了8个黄花蒿品种（品系）的遗传结构，旨在了解供试材料的遗传结构，更好地明确其亲缘关系及其亲和性，以便于指导杂交育种中亲本的选配，为黄花蒿资源的合理利用和科学保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集和基因组DNA的制备 供试8个黄花蒿品种（品系）于2012年种植于重庆涪陵青蒿基地，具体命名和来源为：POP1，POP2均从英国约克大学引进（前者种植于重庆酉阳，后者种植于重庆涪陵）、POP3为“渝青1号”、POP4为“华立1号”、POP5～POP8均为重庆科瑞南海制药有限责任公司选出的品系。每个品种（品系）分析样本数为24个个体，由重庆市中药研究院李隆云研究员进行鉴定。根据均匀分布、随机取样的原则进行采样，于花期之前选取成熟植株分枝顶端上幼嫩的叶片，放入装有硅胶的自封袋内，使之快速干燥。回到实验室后，小心取出干叶片，用于基因组DNA的提取。

基因组DNA的制备采用北京天根植物基因组DNA提取试剂盒进行。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性，并用Smart SpeeTM3000型分光光度计（BIO-RAD）测定其浓度和纯度。提取的基因组DNA于-20 ℃条件下保存，扩增时将样品稀释为40 mg·L^-1作为模板。

1.2 SCoT-PCR扩增与检测 SCoT引物采用Collard和Mackill^[9]开发的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。以随机抽取的2个供试材料基因组DNA为模板进行36条SCoT引物的筛选，最终确定20条扩增带型清晰、重复性好的引物用于正式PCR扩增。具体引物、序列见表1。

扩增反应在S1000TM Thermal Cycler 热循环仪（BIO-RAD）上进行。SCoT反应体系总体积15 μL，内含40 ng模板，0.4 μmol·L^-1引物，1 U Taq DNA聚合酶，1.5 mmol·L^-1 Mg2+，200 μmol·L^-1 dNTP，1×PCR buffer。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性1 min， 50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR产物检测 在1×TAE缓冲系统下，扩增产物加入核酸染料在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150 V。当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿约2～3 cm时停止电泳，在Gel Doc XR凝胶成像系统（BIO-RAD）上照相并记录扩增情况。

1.4 数据分析 观察PCR扩增产物凝胶电泳结果，统计清晰、稳定且易于辨认的DNA条带。根据条带的有无，将电泳结果转化为0/1数据矩阵（在同一等位基因位点上有带的赋值为1，无带的为0）。 利用POPGENE 1.31软件得到评价群体遗传多样性的参数：多态位点百分率（PPB）、Shannon′s多样性信息指数（Ho，在物种水平上为Hsp，在品系群体水平上为Hpop）、Nei′s基因多样度指数（H） 、观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、总的基因多样度（Ht ）、品系内基因多样度（Hs）和评价群体遗传结构的参数：基因分化系数（Gst ）、基因流（Nm）、Nei′s遗传距离（D）和遗传一致度（I）。采用UPGMA聚类分析各群体之间的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 SCoT扩增多态性 为评价黄花蒿8个品种（品系）群体的遗传差异性，用筛选出的引物测定了黄花蒿192个样本的SCoT条带多态性，结果列于表1。结果显示，20条SCoT引物在8个品系群体间共扩增出145个位点，其中多态性位点122个。不同引物扩增的位点差异较大，为4～12个，平均为7.3个，其中多态性位点平均为6.1个。每条引物揭示的多态百分率均较高，在40.0%～100.0%，说明SCoT标记的多态检测效率较高，适用于黄花蒿品系的遗传多样性分析。

2.2 品系群体的遗传多样性 运用POPGENE软件计算得到8个品种（品系）间和品种（品系）内的遗传多样性指标 （表2）。总的遗传多样度（Ht）=0.217 3，品种（品系）内遗传多样性（Hs）=0.121 5，品种（品系）间的基因多样度（Dst=Ht-Hs）为0.095 8。在物种水平上：多态位点百分率PPB=84.1%、有效等位基因数Ne=1.348 2，Nei′s基因多样度指数H=0.217 3以及Shannon′s多样性信息指数Hsp=0.341 9。在品种（品系）群体水平上：各个品种（品系）的多态位点百分率（PPB）差异较大（22.1%～50.3%），平均为41.9%；平均有效等位基因数（Ne）为1.202 6，平均Nei′s基因多样度指数（H）为0.121 5，品种（品系）间的Shannon′s多样性信息指数介于0.113 6～0.222 8，平均Hpop为0.186 8 。

以上数据表明在物种水平上黄花蒿8个品种（品系）具有较丰富的遗传多样性。在品种（品系）群体水平上8个品种（品系）的遗传多样性较低，且差别较大，其中国内品种（品系）的遗传多样性水平最高，国外品种最低。品种（品系）群体的多态位点百分比、有效等位基因数、Shannon′s多样性信息指数和Nei′s基因多样度指数的计算结果均显示了各品种（品系）的遗传变异由高到低依次为POP5>POP6=POP7>POP3>POP4>POP8>POP2>POP1。

2.3 品系群体的遗传结构 POPGENE计算出评价8个品种（品系）群体的遗传结构的遗传参数为： Nei′s的基因分化系数Gst=0.441 0，即44.1%的遗传变异存在于品种（品系）间，55.9%的遗传变异存在于品种（品系）内，表明品种（品系）内的遗传分化大于品种（品系）间的分化，说明品种（品系）群体内变异是黄花蒿品种（品系）的主要变异来源；黄花蒿品种（品系）间基因流（Nm ）=0.633 9<1，表明基因交流处于低等水平，遗传分化程度较高；黄花蒿8个品种（品系）间的Nei′s遗传一致度（I）在0.755 1～0.985 7，平均为0.876 5，遗传距离分布在0.014 4～0.280 9，平均为0.137 4（表3）。

2.4 品系间聚类分析 为了更直观地揭示8个黄花蒿品种（品系）间的亲缘关系，根据Nei′s遗传距离，采用UPGMA聚类法对8个品种（品系）进行了聚类分析（图1）。聚类结果表明国外引进品种POP1和POP2聚为第Ⅰ类，国内品种（品系）聚为第Ⅱ类。在第Ⅱ类中，育成品种聚为一类，具有育种潜力品系聚为另一类。

3 讨论

3.1 黄花蒿物种水平上的遗传多样性 我国黄花蒿物种水平上的遗传多样性较高，可以体现在形态、化学成分、DNA分子水平3个层次上。从表型遗传多样性来看，黄花蒿广泛分布于各省区（从海拔50 m的沿海地带到海拔3 650 m的青藏高原均有分布），随着海拔、气候、植被、土壤等各种生态因子的变化，黄花蒿植株从高矮到叶色、叶形、株形等均表现出极高的表型遗传多样性[5，8，10-11]。从青蒿素化学成分的多样性来看，黄花蒿虽然为世界广布种，但国外黄花蒿中青蒿素质量分数多低于0.1%，甚至微量，即使是同为我国资源，青蒿素的含量随产地不同而差异极大，广西、四川等地黄花蒿中青蒿素含量相对较高，质量分数在0.4%～1.0%，北方地区多在0.1%左右^[11]；此外，据研究青蒿素含量高低与黄花蒿植株茎秆的颜色与粗细、叶片的颜色与疏密、叶型、节间长、茎枝间夹角等相关^[11-14]。从DNA分子水平上看，郑丽屏等首先用RAPD标记揭示10份黄花蒿的多态百分率为53.6%^[5]；石开明等采用RAPD和ISSR分子标记揭示鄂西地区11份黄花蒿的多态比率分别为61.6%，60.8%^[7]，其中RAPD标记的效率高于文献报道^[5]；ISSR标记揭示40份青蒿素高含量地区黄花蒿的多态比率为79.8%^[15]，高于文献报道^[7]；新型分子标记SRAP揭示全国各地45份和60份野生黄花蒿种质的多态百分率基本相同（分别为81.7%^[6]，81.5%^[16]），证实野生黄花蒿具有丰富的遗传变异；本文供试的8个黄花蒿品种（品系）虽然经历了目标性状的定向选择，但基于SCoT标记揭示其在物种水平上的遗传多样性较高（多态百分率为84.1%），同时也提示SCoT的多态检测效率高于文献报道的其他标记[4-8，15-16]，适用于评价黄花蒿种质资源的遗传多样性。国外学者利用RAPD分子标记技术对产于印度的黄花蒿进行多态性检测，发现植株化学物质的显著差异源于遗传性状的多态性，说明用遗传学手段选育青蒿素高产系是可行的^[4]；我国学者采用RAPD标记也证实黄花蒿遗传分化与青蒿素含量变化及地理分布基本对应^[5]。

综上所述，无论是形态标记、化学标记，还是分子标记均表明黄花蒿在物种水平上遗传多样性较为丰富，原因可能与其分布范围广泛、异花授粉的繁育方式有关。从分子水平上揭示黄花蒿遗传多样性不仅与分子标记的选择有关，同时与分析样本的数量以及来源有关。总体上来说，样本的数量越多、来源越广泛，就越能代表黄花蒿种质资源真实的遗传多样性；分子标记的选择上，新型分子标记SCoT和SRAP是有效的标记，完全可以用于黄花蒿遗传多样性的评价。

3.2 黄花蒿居群水平上的遗传多样性 现有黄花蒿遗传多样性方面的文献报道大多是用单个个体或多个个体的混合“DNA”基因池来代表该居群，适用于遗传多样性的初步判断，而根据均匀分布、随机取样的原则用多个个体代表该居群，能同时反映居群间和居群内遗传多样性的文献报道较少。本研究采用后一种取样策略，样本数为每个（品种）品系24个个体，计算出的各遗传参数均表明居群水平上遗传多样性较低，推测与长期目标性状的定向选择有关。此外，品种（品系）群体之间遗传多样性的水平的差异较大：国内品种远高于国外引进品种，说明国内品种遗传变异基础大于引进品种，品种纯度有待提升；国内具有育种潜力品系的遗传多样性水平高于已育成品种，说明品系的遗传一致度仍需进一步纯化。

3.3 黄花蒿的遗传结构 本研究运用遗传分化系数和基因流2个遗传参数评价黄花蒿8个品种（品系）群体的遗传结构。遗传分化系数表明品种（品系）内的遗传分化大于品系间的分化，即群体内变异是黄花蒿品种（品系）的主要变异来源。这种遗传结构特点预示着在黄花蒿育种进程中，仅仅采用有性繁殖方式来提高品种的纯合度有较大难度。黄花蒿为异花授粉植物，群体中选择的优育目标性状在后代分离明显。现行的获得纯合系的方法一是自交法，二是母系选择法，但黄花蒿自交不亲和^[17]，连续自交产生的极少量种子又容易衰退，所以大多采用耗时较长的母系选择法，如何将有性繁殖（种子）和无性繁殖（组织培养或花药或小孢子培养）结合起来加快育种的进程，获得性状稳定的纯合系成为育种工作者的关注点。

品种（品系）之间的基因流Nm =0.633 9<1，表明基因交流已严重受阻。植物自然种群间的基因流是借助于花粉、种子、植株个体以及其携带遗传物质的物体为媒介进行的，其中花粉和种子的扩散是主要的媒介，而黄花蒿品种选育过程中人为隔离阻断了花粉和种子介导的基因流，导致品种（品系）群体间遗传分化显著。据黄花蒿不同基因型杂交试验表明通过群体杂交获得的一些杂交株系富含青蒿素，说明优中选优可以获得好的遗传材料^[18]，因此黄花蒿品种选育过程中，尚需不断发掘黄花蒿野生或栽培种质中的优异基因，充分利用杂种优势创造优质种质资源，拓宽种质的遗传基础。

[参考文献]

[1] 郭长强，朱海，赵渤年. 引种黄花蒿的黄花蒿素含量测定[J]. 中药材，1996，19（12）：597.

[2] 张小波，郭兰萍，黄璐琦. 我国黄花蒿中青蒿素含量的气候适宜性等级划分[J]. 药学学报，2011，46 （4）： 472.

[3] 钟国跃，周华蓉，凌云，等. 黄花蒿优质种质资源的研究[J].中草药，1998，29（4）：264.

[4] Sangwan R S， Sanqwan N S， Jain D C， et al. RAPD profile based genetic characterization of chemotypic variants of Artemisia annua L[J]. Biochem Mol Biol Int，1999，47（6）：935.

[5] 郑丽屏，王剑文，谭仁祥. 黄花蒿种质资源的RAPD分析[J]. 中草药，2007，38（4）：602.

[6] 陈大霞，李隆云，瞿显友，等. 青蒿种质资源遗传多样性的SRAP分析[J].分子植物育种， 2007，6（s）： 52.

[7] 石开明，艾训儒，丁莉，等. 鄂西地区青蒿遗传多样性研究[J].湖北农业科学，2008， 47 （7）：740.

[8] 蒋向辉，佘朝文，谷合勇，等. 形态标记与RAPD标记在青蒿种质资源分类中的应用[J].江苏农业科学， 2008，6：76.

[9] Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted（SCoT） polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Mol Biol Rep， 2009，27（1）：86.

[10] 罗安才，蔡志华，静一，等. 重庆青蒿中青蒿素含量及其AFLP分析[J]. 分子植物育种，2009， 7（6）：1144.

[11] 黄正方，郑贵华. 影响青蒿成分（青蒿素）含量的因素研究[J]. 西南农业大学学报，1997，19（1）：93.

[12] 朱卫平. 野生黄花蒿的引种驯化和高青蒿素含量栽培品种选育目标性状的研究[D]. 长沙：湖南农业大学，2003.

[13] 孙婵. 黄花蒿育种系青蒿素含量动态变异的研究[D]. 长沙：湖南农业大学，2004.

[14] 韦霄，李锋，傅秀红，等. 黄花蒿类型引种试验[J]. 广西科学院院报，1998，14（1）：28.

[15] 陈大霞，李隆云，彭锐，等. 青蒿素高含量地区黄花蒿种质资源的简单重复序列区间分析[J]. 中国药房，2011，22（11）：1026.

[16] 陈大霞，彭锐，李隆云，等. 我国黄花蒿天然群体遗传多样性的SRAP分析[J]. 中草药， 2011，42（8）：1591.

[17] 杨丽英，李绍平，谷安宇，等. 黄花蒿繁殖生物学初步研究[J]. 西南农业学报，2008，21（4）：1036.

[18] Delabays N，Simonnet X，Gaudin M. The genetics of artemisinin content in Artemisia annua and the breeding of high yielding cultivars[J]. Curr Med Chem， 2001，8（15）：1795.

Genetic structure and genetic diversity of Artemisia annua varieties （strains）

populations based on SCoT markers

CHEN Da-xia， CUI Guang-lin， ZHANG Xue， LI Long-yun*

（Institute of Material Medical Planting， Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing Research

Center of Techniques and Engineering for Chinese Materia Medica Fine Variety

Breeding and Evaluation， Chongqing Key Laboratory of Chinese Medicine Resources， Chongqing 400065， China）

[Abstract]To reveal the genetic diversity and genetic structure in Artemisia annua varieties （strains） populations， we detected the genetic polymorphism within and among eight varieties （strains） populations （192 individuals） by the approach of Start Codon Targeted Polymorphism （SCoT）. The associated genetic parameters were calculated by POPGENE1.31 and the relationship was constructed based on UPGMA method. The results showed that， using 20 screened primers， a total of 145 bands were produced， of which 122 were polymorphic loci. At species level， there was a high level of genetic diversity among eight varieties （strains） populations （PPB=84.1%，H=0.217 3 and Hsp=0.341 9）. However， at the variety （strains） population level， genetic diversity was lower， the average of genetic parameters was PPB=41.9%，H=0.121 5，Hpop=0.186 8. The Nei′s genetic differentiation coefficient was 0.441 0， indicate that most of the genetic variation in this species existed within the variety populations. The gene flow （Nm=0.633 9） was less among populations， indicating that the degree of genetic differentiation was higher. Genetic similarity coefficient were changed from 0.755 1 to 0.985 7. By clustering analysis， eight varieties （strains） were clustered into two major categories and it was also showed the same or similar genetic background varieties（strains） have a tendency to gather in the same group. Results suggest that， in variety breeding， breeders should strengthen the exchange of bred germplasm and increase mutual penetration of excellent genes， which would broaden the genetic base of A. annua.

[Key words]Artemisia annua； genetic diversity； genetic structure； SCoT

推荐访问:遗传 黄花 品系 多样性 群体