摘要：过继免疫治疗是当前医学研究的重点内容，在细胞免疫中，A-NK细胞作为肿瘤过继免疫治疗（AIT）中的一种新型免疫效应细胞，具有短期内大量增殖，调节机体免疫能力，抗菌，抗病毒，抗衰老，抗肿瘤的特点受到普遍关注，临床应用也显示出广阔前景。本文追踪国际上研究进展就有关A-NK细胞生物学特性，免疫调节及临床应用的研究现况及进展作以简要综述。
关键词：过继免疫治疗；A-NK；临床应用
中图分类号：R473.73 文献标示码：A
近年来，随着人类疾病治疗学的进展，过继免疫治疗（AIT）成为免疫生物治疗中的主要疗法之一。从80年代后期，LAK、TIL、NK、CTL、DC、CIK等效应细胞陆续被发现，国内外的基础和临床应用报道层出不穷。1988年美国Pittsburgh大学首次从LAK细胞群体中分离纯化了一种具有高效杀伤活性的LAK亚群，由于它具有粘附在塑料表面的特征将其命名为A-LAK（ad herent LAK）。之后， 随着A-LAK研究的深入和进展，我们发现其与LAK之间有着诸多不同之处， 而与NK细胞具有相同的表面标志，相似的生物学活性，本课题组近年多以A-NK（activated NKcells）代替A-LAK这个名称。
1 A-NK的生物学特征
A-NK可来源于人外周写单个核细胞（PBMNC）、骨髓、淋巴结、脾细胞、脐带血等，其中后两者是最好的A-NK来源。美国Pittsburgh大学Vujanovic课题组最初分离制备A-NK时提出，A-NK可能来源于大淋巴细胞，因为在形态、表型特征和生物学活性方面，二者具有同源性[1]。1990年Melder通过A-NK形态及超微结构研究指出，初次分离的A-NK在粘附相及非粘附相之间周期性波动。动态观察有无IL-2条件下常规NK的粘附状态表明，只有相当少的一部分NK（1%～10%）具有自发粘附到塑料表面的特性，但在6000IU/mlIL-2存在时，一部分（4%～30%）NK也可以迅速转化为粘附NK，24h后这部分细胞又失去粘附活性。因此，IL-2诱导NK粘附作用只是非常迅速的一个过程。A-NK的超微结构与高度活化的NK一致，所有的A-NK均为球形，表面有众多绒毛和伪足。在粘附相，A-NK也是可动的，一般可沿着固体表面移动1μm/min，1个极性末端是有皱而毛糙的边角结构，另一端绒毛呈线圈样。用透射电镜也证实A-NK结构高度极化，一端为细胞核，另一端为细胞浆，颗粒丰富，骨架结构较大，具有多囊泡小体和活跃的Golgi小体[2]。此后研究进一步明确，A-NK来源于成熟静息状态的NK亚群，占全部单个核细胞的1%～4%，占总NK的15%～50%，与未成熟NK或活化的终末NK细胞不同。A-NK代表了表型和功能独特的NK亚群。用流式细胞仪（FACS）进行A-NK表面标志分析显示，A-NK表达CD56dim -CD16dim -β2 intergrinsbrightIL-2Rp75+表型，A-NK和NK一样，其表面有多种复杂的粘附分子（CAM）存在，并与其生物学活性息息相关。为了评价CAM在A-NK粘附特性中起的作用大小，Melder发现CD11c，CD11a，CD18分子在活化的NK与内皮细胞相互作用中起关键作用，与A-NK粘附于肿瘤血管而短暂停留于正常组织的现象有关。也有学者证实CD18相关的层粘连素CD11a，CD11b，CD11c，CD2在A-NK与靶细胞的相互识别中起重要作用。Gunji Y指出A-NK是大颗粒淋巴细胞，表达NK细胞表型膜标志（asialo GM1+， NK1.1+， Qa5+， Ly-6.2+， Thy-1.2+，但Lyt-2.2 and L3T4阴性），具有相对较高的细胞毒性[3]。图1为本课题组提取活化的A-NK免疫效应细胞，它通过突触粘附至癌细胞（扫描电镜）。图2显示A-NK细胞聚集，粘附至癌细胞周围，形成花环状，肿瘤细胞呈现空泡变性，细胞膜损伤、溶解等坏死征象（透射电镜）。
2 A-NK的肿瘤治疗研究
2.1 A-NK体外增殖能力和抗肿瘤能力 A-NK优点主要有2点：①是抗肿瘤能力强；②是体外扩增能力强。在自体条件培养基（AuCM）存在条件下，A-NK可于20d内扩增130～1100倍，临床级A-NK扩增倍数稍低，但也可于8～14d内扩增10～22倍。以22nmol/mlIL-2诱导下是否能迅速粘附到实体表面的能力，NK被分为两种不同亚群，A-NK和NA-NK[2]。分别培养二者作动态比较，A-NK增殖能力始终强于NA-NK，但诱导力迟于NA-NK。在抗瘤能力方面，A-NK结合并杀伤K562和Daudi细胞的能力明显高于NA-NK，并能侵润到肿瘤细胞囊球内部杀伤肿瘤细胞。大量体外实验表明，A-NK抗NK敏感性K562，NK抵抗性Daudi、Raji及新鲜肾细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌的能力远强于常规LAK。体内实验也证明，A-NK和IL-2过继输注几乎能完全抑制在裸鼠体内建立的人头颈部鳞癌模型肿瘤的生长，对胃癌肝转移模型能明显减少肝内转移瘤数目并延长小鼠生存期[3]。A-NK/IL-2疗法对实体瘤的治疗结果很大程度上取决于A-NK在肿瘤部位的聚集能力。这种选择性聚集能力至少受五种因素影响：①肿瘤血管的构造和超微结构；②A-NK的不规则外形；③IL-2激活的A-NK刚性增强；④A-NK表面高度表达的CAM与机体血管及肿瘤微循环的相互作用；⑤肿瘤组织可能分泌一些趋化性介质，如TGFβ，IL 6等，吸引和促进A-NK聚集和粘附。实验发现静脉注射的A-NK很快就在肺脏和肺部转移灶聚集和停滞，只有相当少的一部分A-NK随后进入循环。到达肺部转移灶的A-NK一部分来源于血液，另一部分从周围的肺组织移行过来。而到达肿瘤特定部位的A-NK细胞数量多少是关系到疗效好坏的关键步骤。自从1991年日本Basse P提出局部输入A-NK可以更好地使其聚集在已建立的荷瘤鼠模型的肝癌或肺癌部位之后，A-NK的研究者们意识到其体内存活及分布情况与输入途径及IL-2剂量密切相关。Sacchi使用肿瘤局部注射A-NK和IL-2在建立的人头颈部鳞癌鼠模型中获得了良好疗效，并显著减少了全身治疗的副作用。1998年Heganaars使用荧光标记A-NK，在小鼠肝癌模型上比较了三种输注途径（通过肝动脉、门静脉和颈静脉给药）A-NK的选择性聚集情况，结果发现肝动脉途径A-NK在肿瘤部位聚集最多，其次是门静脉，而颈静脉途径最少。这说明局部注射A-NK比静脉给药的全身治疗具有更确切的效果和更大的潜力，A-NK的局部应用成为研究者们关注和提倡的给药途径[4-8]。