摘要：目的 探讨不同浓度的人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素对体外3T3-L1脂肪细胞瘦素（leption）mRNA表达的影响。方法 通过不同浓度人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素刺激分化后的3T3-L1脂肪细胞,实时荧光定量PCR法测定瘦素mRNA表达。结果 随着人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素浓度的升高,瘦素mRNA表达逐渐升高,相同浓度的地特胰岛素、甘精胰岛素和人胰岛素对瘦素mRNA的促进作用有统计学意义（P<0.05）。结论 体外人胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素均可使分化后3T3-L1细胞瘦素表达增加；人胰岛素对3T3-L1细胞瘦素表达增加的作用最强，甘精胰岛素次之，地特胰岛素最弱。
关键词:人胰岛素；甘精胰岛素；地特胰岛素；瘦素；瘦素mRNA； 3T3-L1脂肪细胞
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）06-0717-03目前胰岛素类似物广泛应用于临床，为糖尿病患者带来方便，改善了患者的生活质量，减少了低血糖等严重并发症的发生，随着血糖的良好控制对远期并发症也将有良好的预防作用。但胰岛素类似物改变了人胰岛素的氨基酸组成和分子结构，而使得其发挥作用的时间、在人体内的代谢速度与人胰岛素有很大的区别，它对人体其他方面的作用还有待于将来大量的临床观察。本研究采用人胰岛素、胰岛素类似物（甘精胰岛素和地特胰岛素）分别处理分化后3T3-L1脂肪细胞，检测瘦素mRNA表达的变化，探讨胰岛素类似物与瘦素的相互关系。
1 材料与方法
1.1 主要实验用品及化学试剂 DMEM/F12（1∶1）培养基购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物有限公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、三碘甲状腺原氨酸、人胰岛素、地塞米松均购自Sigma公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素由甘李药业有限公司提供；青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司；细胞培养板购自Corning公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；引物由上海生工生物工程技术服务公司合成；RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司；Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）购自Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 3T3细胞-L1前脂肪细胞的分化 将3T3- L1前脂肪细胞接种于培养瓶中，在37 ℃、5% CO【sub】2【/sub】的条件下用含10% FBS的DMEM/F12培养液培养,48 h换液一次，待细胞融合生长后按1∶2传代，取同代对数生长期细胞，用含10%FBS的DMEM/12培养液配成单细胞悬液，细胞计数器计数，调整细胞密度为5×10【sup】4【/sup】/mL，接种于6孔培养板，每孔4 mL。CO【sub】2【/sub】孵箱培养24 h，待细胞达到80%汇合后开始换加分化培养基，其中含胰岛素0.25 μmol/L、甲状腺素0.2 nmol/L、地塞米松0.25 nmol/L、IBMX0.5 nmol/L，每48 h换液1次，每孔4 mL，换液2次之后，撤掉IBMX，用胰岛素、地塞米松、甲状腺素维持培养。
1.2.2 不同浓度甘精、地特、人胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达的量效作用 3T3- L1前脂肪细胞分化第10天后改用DMEM/F12培养液培养24 h，消除诱导液的影响，分别加入含终浓度为1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的人、甘精和地特胰岛素，另设空白对照组。每组设3个复孔，继续培养24 h，提取细胞总RNA。
1.2.3 瘦素mRNA的检测 Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR仪进行逆转录构建cDNA模板，逆转录反应条件参照试剂盒说明。参照NCBI中的基因序列设计引物：目的基因Leptin（上游引物：5′- CTATGCCACCTTGGTCACCT- 3′，下游引物：5′- ACCAAACCAAGCATTTTTGC-3′ ，扩增片段长度：121bp）,管家基因GAPDH（上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物：5′- TCCACCACCCTGTTGCTGGA- 3′，扩增片段长度：307 bp）。PCR反应体系:cDNA5.0 μL，Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）25.0 μL,上下游引物各0.5 μL,用DEPC -H【sub】2【/sub】O 补足至50 μL体积。实时荧光定量PCR仪扩增条件:瘦素95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40个循环。以GADPH为管家基因，对照孔（无胰岛素刺激）为校正值，采用2－【sup】△△Ct【/sup】法计算基因表达的相对变化【sup】［1］【/sup】。△△Ct（Ct【sub】目的基因【/sub】-Ct【sub】管家基因【/sub】）待测样本-（Ct【sub】目的基因【/sub】-Ct【sub】管家基因【/sub】）样本校正，校正样本是任何被选做代表l倍目的基因表达量的样本。逆转录反应条件参照试剂盒说明。实验重复3 次,每组设3孔重复（N3,n3）。
1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行处理，所有数据以均数±标准差（x±s）表示,对各种浓度的4种胰岛素处理后瘦素mRNA的表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验法。
2 结 果
2.1 不同浓度甘精、地特、人胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达的量效作用 对照组（0 nmol/L）瘦素mRNA表达为1。瘦素mRNA表达随每种胰岛素质量浓度增高而升高，呈量效依赖性，与对照组相比，瘦素mRNA的表达差异有统计学意义,说明不同质量浓度不同胰岛素作用24 h均能促进分化后的3T3-L1脂肪细胞的瘦素mRNA表达。详见表1。
表1 相同胰岛素不同浓度对3T3-L1脂肪
细胞瘦素mRNA表达的影响（ x±s）
2.2 相同浓度的不同胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达 1 nmol/L人、甘精、地特胰岛素刺激分化成熟的3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA表达分别为5.78±0.21，3.77±0.24，3.85±0.17，1.87±0.11；10 nmol/L时分别为11.32±0.68，8.19±0.47，7.96±0.23，2.85±0.17；100 nmol/L时分别为30.64±0.84，25.43±0.64，24.93±0.76，5.92±0.14；4种胰岛素间差异均有统计学意义（P<0.05），同浓度的不同胰岛素刺激分化后的3T3-L1脂肪细胞，作用24 h，瘦素mRNA表达的促进作用，人胰岛素最强、甘精胰岛素次之，而地特胰岛素最弱。
3 讨 论
瘦素是Zhang等【sup】［2］【/sup】于1994年发现其基因定位并命名,主要由脂肪组织分泌的蛋白质，具有在下丘脑水平抑制摄食，增加能量支出、调节体重、调节免疫反应及影响心血管系统等诸多功能。瘦素和胰岛素是调节体内物质与能量代谢的两种重要激素，二者间关系密切，体内外实验均表明,人胰岛素与瘦素呈较强的正相关关系【sup】［3］【/sup】。胰岛素能刺激瘦素分泌,增加瘦素mRNA表达,同时瘦素又能直接抑制胰岛素分泌【sup】［4］【/sup】。Lee等【sup】［5］【/sup】用脉冲追踪实验证实注射胰岛素30 min即可刺激瘦素的分泌。在啮齿类动物中,胰岛素可增加瘦素mRNA的表达,并在进食诱发的低胰岛素血症时,脂肪组织ob mRNA水平显著降低。研究发现体外情况下，地特胰岛素对3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA的表达表现为促进作用，但这种作用较人胰岛素弱【sup】［6］【/sup】。
本研究中亦发现人胰岛素随着浓度的增加，作用24 h，对3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA的表达表现为促进作用，可明显看出这种促进效应呈剂量依赖性。甘精、地特胰岛素随着浓度增加，作用24 h，对3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA的表达也表现为促进作用，且呈剂量依赖性。Leroy等【sup】［7］【/sup】认为胰岛素通过增加ob基因的表达从而促进瘦素mRNA的表达。
肥胖症与2型糖尿病发病密切相关,肥胖机体过度表达瘦素,瘦素在介导胰岛素抵抗中起重要作用,它从不同层次、不同环节干扰了胰岛素的生理功能,高瘦素血症与高胰岛素血症是人类肥胖症的共同特点。生理状态下,胰岛素促进脂肪合成,抑制脂肪分解,刺激脂肪细胞分泌瘦素,而瘦素通过胰岛细胞膜的受体,作用于胰岛β细胞,抑制胰岛素的分泌,从而降低脂肪的同化作用,减少脂肪的储存。这种反馈调节机制一旦被打破,瘦素抑制胰岛素分泌的能力下降,导致高胰岛素血症的发生。高胰岛素血症是预示2型糖尿病发生的一个危险信号【sup】［8，9］【/sup】。2型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛素B细胞功能缺陷为主的疾病，病程中存在不同程度的胰岛素抵抗，Asilmaz等【sup】［10］【/sup】研究证实，生理浓度的瘦素增强胰岛素敏感性，而高浓度瘦素可使周围组织对葡萄糖敏感性减弱，从而加重胰岛素抵抗。
Kennedy等【sup】［11］【/sup】研究表明,高瘦素血症与胰岛素抵抗显著相关,这可能由于高瘦素血症不能反馈抑制胰岛素的分泌,而出现高胰岛素血症所致。马红等【sup】［12］【/sup】采用多元逐步回归法分析,去除体重指数等因素的影响后,瘦素与胰岛素曲线下面积呈正相关。本研究发现在体外情况下，同浓度的三种胰岛素刺激分化成熟的3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA表达的促进作用人胰岛素最强、甘精胰岛素次之，而地特胰岛素最弱。这可能与人胰岛素，甘精胰岛素和地特胰岛素与细胞内胰岛素受体的亲和力有关【sup】［6］【/sup】。
由此可见，甘精胰岛素和地特胰岛素均可促进瘦素表达水平，但对瘦素的促进作用均弱于人胰岛素，且地特弱于甘精，提示在肥胖症的糖尿病患者使用这两种胰岛素类似物和人胰岛素时是体内高瘦素血症的程度可能会有所不同，从而对胰岛素抵抗的程度产生重要的影响。这也为临床上个糖尿病病人个体化胰岛素治疗提供了新思路，但其具体调节机制还有待进一步研究，人体是一个复杂的整体，体外情况不能说明其在体内综合过程的结果，还需要大量的研究和临床观察。
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作者简介：王丽，现为山西医科大学在读研究生（邮编：030001）；杨静（通讯作者）、阴津华，工作于山西医科大学第一医院（邮编：030001）。
（收稿日期：2011-01-12）
（本文编辑 郭怀印）