对照的32.4，4.8倍，毛状根中丹参酮积累增加，最高达到对照的10.2倍；加入活性氧抑制剂CAT和SOD后，丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降，HMGR和DXR基因表达也明显下降，毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累，Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径，从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。
[关键词] 丹参毛状根；活性氧；密旋链霉菌Act12；次生代谢；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶； 1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸还原异构酶
[收稿日期] 2013-10-27
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81373908）；陕西省重大产业集群荐项目（2012KTCL02-07）
[通信作者] 梁宗锁， 教授， 博士生导师， 主要从事中药材规范化栽培的理论与技术研究， Tel：（029）87014582，Fax：（029）87092262，E-mail：liangzs@ms.iswc.ac.cn
[作者简介] 阎岩， 博士研究生， 主要从事药用植物次生代谢研究， E-mail：sunnylikeme@163.com
丹参为唇形科植物丹参Salvia militorrhiza Bge.的干燥根及根茎，在我国很早就有把丹参作为药材使用的记录，最早记载于《神农本草经》，被列为上品，在梁朝，唐朝，五代以及明朝的中医药著作中也都有对丹参入药的记载[1]。丹参酮作为丹参的一类重要次生代谢物，其药理作用十分显著，目前的研究表明丹参酮类物质具有抗癌[2-3]，抗氧化[4]，心脏保护[5-6]，神经保护[7-8]，治疗糖尿病[9]等药理作用。随着对丹参酮类物质研究的深入，丹参酮的药用价值进一步显现，已成为丹参研究的重点。
2条代谢途径被认为参与了丹参酮的合成，1条是存在于胞质的甲羟戊酸途径（MVA），1条是存在于质体的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是MVA途径上的关键酶，其催化从3-羟基-3-甲基戊二酰到甲羟戊酸的过程；1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸还原异构酶（DXR）是DXP途径的上的关键酶，其使1-脱氧-木酮糖-5-磷酸原子重排和还原生成MEP[10-11]。
活性氧（reactive oxygen species， ROS）包括超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2），羟基自由基（HO·）等。活性氧起初被认为是植物进行有氧代谢时产生的有害物质，植物通过体内高效的活性氧清除体质对其进行抑制。抗氧化体系包括了超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（CAT），抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽过氧化酶（GPX）。SOD可以将O2-转化为H2O2，接着CAT和APX则可以清除H2O2。但近些年的研究结果越来越多的表明活性氧植物体内一类重要的信号物质，是植物体内的活性氧清除机制不仅仅是简单的对活性氧进行清除，而是引导其成为短暂的活性分子参与到细胞的信号转导中[12]。活性氧作为信号物质已经被证明参与了植物生长发育[13-15]，植物种子萌发[16-17]，植物对外界生物和非生物刺激的防御反应[18]，细胞的程序性死亡等生物学过程[19-20]。已经有很多研究证明干旱胁迫，紫外光等一些环境因素可以促进植物次生代谢物的积累，而活性氧也参与了促进次生代谢物积累的过程[21]。然而，活性氧在生物诱导子诱导毛状根中次生代谢产物积累中作用的报道还比较少。
作者以前的实验已经证明密旋链霉菌Act12（Act12）可以通过上调HMGR和DXR基因的表达，从而大幅提高丹参毛状根中丹参酮类物质的含量。本研究以CAT和SOD作为活性氧清除剂，研究活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用。
1 材料与方法
1.1 毛状根的培养 使用ATCC15834发根农杆菌诱导商洛丹参无菌苗叶片获得丹参毛状根。毛状根保存在含有30%蔗糖的无激素和硝酸铵的固体MS培养基，25 ℃避光保存，取0.3 g 3周龄的丹参毛状根放入含有40 mL液体无硝酸铵的MS培养基（100 mL三角瓶）中，置于摇床上110～120 r·min-1，25 ℃避光培养至21 d备用[22-23]。
1.2 密旋链霉菌Act12诱导子及SOD，CAT溶液的制备及处理 密旋链霉菌Act12由西北农林科技大学资源与环境学院提供。使用斜面高氏1号固体培养基在4 ℃下保存。菌株活化2次后接入液体的高氏1号培养基，在28 ℃， 220 r·min-1条件下培养9 d后加入到培养了21 d的丹参毛状根中，SOD（Sigma， USA）和CAT（Sigma， USA）处理的同时加入1 000 U·mL-1的SOD，CAT，处理后的第7天和第14天采收毛状根，用蒸馏水清洗净后放入烘箱，45 ℃烘干至恒重。收集培养基使用苯酚硫酸法测定培养基中残余糖并使用相应仪器测定培养基的pH、电导值。