[摘要] 目的 观察双氢青蒿素对人卵巢癌细胞HO-8910裸鼠移植瘤生长及Ang-2表达的影响。 方法 建立人卵巢癌细胞株系HO-8910裸鼠皮下移植瘤模型。实验分为空白组、顺铂组、青蒿素高剂量组、青蒿素低剂量组、青蒿素高剂量+顺铂组（各组n=5），观测各组小鼠成瘤情况，肿瘤重量差异以及常规病理检查变化，并采用免疫组化法检测肿瘤组织内Ang-2表达情况。 结果 与给药组比较，对照组小鼠体重大、生长快（P＜0.05）。与青蒿素低剂量组比较，高剂量组、顺铂组和联合组肿瘤生长较慢，重量减轻，其抑瘤率分别为49.24%，56.06%，75.00%，差异有统计学意义（P＜0.01）。其中联合用药组效果最好（P＜0.05），而高剂量组和顺铂组差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果提示给药组中Ang-2的含量明显低于对照组（P＜0.05），高剂量组比低剂量组更少（P＜0.05），而联合处理组几乎未见Ang-2的表达。结论 双氢青蒿素对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用且成剂量依赖性，与化疗药联合应用效果更好，其机制可能是青蒿素下调Ang-2的表达，直接或间接影响肿瘤组织血管生成而发挥抗肿瘤作用。
[关键词] 双氢青蒿素；Ang-2；卵巢癌细胞株；裸鼠
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）04-36-03
Effect of dihydroartemisinin on transplant human HO-8910 ovarian tumor growth in nude mice and Ang-2 expression
REN Jing1 SHI Xiaorong2
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2. Department of Obstetrics and Gynecology, the First Clinical Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030012,China
[Abstract] Objective To investigate the effect of Dihydroartemisinin(DHA) on HO-8910 human ovarian cancer tumor growth in nude mice and Ang-2 expression. Methods Human HO-8910 ovarian tumor models were established in nude mice,and the mice were divided into the control group,DDP group,DHA high-dose group,DHA low-dose group,DHA with DDP group (n=5).The tumor growth cases,differences in tumor weight and pathological routine examination were observed,and the expression of Ang-2 in tumor tissue were detected by immunohistochemistry. Results Comparing with treatment group,the control group had larger tumor, faster growth, and the differences were statistically significant(P＜0.05).Comparing with DHA low-dose group,DHA high-dose group, DDP group and combination treatment group were slower growth and weight,and the tumor inhibitory rates were 49.24%, 56.06%,75%,respectively.There were significant differences between them(P＜0.01),and the combined treatment group seems to be better(P＜0.05).Tumor weight changes between DHA high-dose group and DDP group were no significant differences(P＞0.05). Immunohistochemical results suggest that Ang-2 in the treatment group were significantly lower than the control group(P＜0.05),high-dose group less than the low dose group (P＜0.05),while the combined treatment group almost no Ang-2 of expression. Conclusion DHA on human ovarian cancer transplanted in nude mice can inhibited tumor growth in a dose-dependent,combining with chemotherapy drugs, the effect should be better.The mechanism may be reduced the expression of Ang-2,which directly or indirectly affects tumor blood vessels building to promote tumor disappeared.
[Key words] Dihydroartemisinin;Ang-2;Ovarian cancer;Traditional Chinese medicine
青蒿素（artemisinin）是从菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，除在临床上治疗疟疾具有显著疗效外，尚有确切的抗肿瘤作用[1]，其机制可能涉及抑制细胞增殖、促进凋亡、抗血管生成及耐药逆转等方面。血管生成素-2（angiopoietin -2，Ang-2）是血管生成素家族（angiopoietin family，Ang）的重要一员，定位于8q23.1，包括9个外显子和8个内含子，其编码的产物糖蛋白为分子质量约75 ku的同源二聚体，人鼠同源性为85%，研究已证实Ang-2可促进肿瘤的血管生成，从而参与多种肿瘤的发生、发展及转移[2-3]。何荣荣等[4]研究发现青蒿素可通过抑制肿瘤细胞Ang-2的表达来减少肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤生长。而双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）作为青蒿素主要衍生物之一，具有更好的水溶性、吸收快、排泄和代谢迅速、高效、低毒等优点[5]。故本实验探讨双氢青蒿素对人卵巢癌细胞株HO-8910裸鼠移植瘤的生长及Ang-2表达的影响及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 接种细胞 人卵巢癌细胞株HO-8910，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.1.2 主要试剂 双氢青蒿素（DHA，重庆华立武陵山制药厂）；顺铂注射液（齐鲁制药有限公司）；Ang-2兔抗人多克隆抗体、DAB试剂盒、SP免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。
1.1.3 实验动物 雌性清洁级BALB/c裸小鼠，25只，4～6周龄，体量18～20 g，由国家噬齿类种子中心-中国药品生物制品检验所实验动物中心提供[SCXK（京）2009-0017]，饲养于山西医科大学实验动物中心SPF级动物房。
1.2 方法
1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 常规培养人卵巢癌细胞株HO-8910，接种于含10%小牛血清的RMPI-1640培养基，置于37 ℃ 5% CO2孵箱中培养，将对数生长期细胞用无血清的RMPI-1640配成浓度为3.0×107/mL的单细胞悬液，接种BALB/c-裸鼠，每只裸鼠腋窝皮下接种0.2 mL。
1.2.2 实验分组 接种20 d后随机（随机数目表法）分为5组（每组5只）：（1）空白对照组（生理盐水）：灌胃给予生理盐水0.2 mL/d，共10 d；（2）阳性对照组（顺铂组）：按每日2 mg/kg腹腔注射给药，共5 d，之后给生理盐水0.2 mL/d，5 d；（3）DHA高剂量组：按每日200 mg/kg灌胃给药，共10 d；（4）DHA低剂量组：按每日100 mg/kg灌胃给药，共10 d；（5）联合处理组：灌胃给予DHA（200 mg/kg）5 d后，腹腔注射顺铂（2 mg/kg）5 d，共10 d。
1.2.3 指标检测 各裸鼠接种细胞前分别称重。接种细胞后每天观察小鼠的一般情况。所有小鼠均隔3天1次测其体重，并绘制体质量曲线图。末次给药后24 h时处死动物，剥离瘤体并称重，计算各组小鼠平均瘤重（W）及抑瘤率（IR）。IR（%）=[1-治疗组平均瘤重/NS组平均瘤重]×100%。同时做大体和病理观察。将肿瘤组织用生理盐水清洗后，10%中性福尔马林浸泡固定标本，常规石蜡包埋，连续4µm切片。部分行HE染色，光镜下观察组织病理学变化；部分肿瘤切片采用免疫组化法检测治疗组和对照组肿瘤组织Ang-2的表达情况。
1.3 统计学处理
应用SPSS13.0软件进行数据处理，数据以（）表示。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠的生长情况
实验初期各组小鼠饮食、行为均表现正常，反应灵敏。后期有个别小鼠出现腹泻、消瘦、弓背、竖毛、嗜睡、行动迟缓等症状。
2.2 治疗组对荷瘤小鼠生长情况的影响
2.2.1 各组小鼠体质量曲线图 每3 天于给药前测量小鼠体重并绘制体质量曲线图。从图1可见，空白组小鼠体重大，生长快，而治疗组小鼠体重均生长缓慢，其中顺铂组、高剂量组、联合组小鼠体重有下降趋势，且联合处理组下降更明显。
2.2.2 各组小鼠的移植瘤重量和抑瘤率 小鼠脱颈处死后，剥离肿瘤组织，称其重量，并计算抑瘤率。统计结果显示：五组间瘤重差异有统计学意义（F=108.762，P＜0.01），两两比较后，除顺铂组与高剂量组间瘤重差异无统计学意义外（P=0.091），其他各两组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。同时，联合处理组的抑瘤率最大（75.00%），DHA低剂量组最小（31.82%）。见表1。
图1 各组小鼠体质量曲线图
表1 各处理组的小鼠移植瘤重量及抑瘤率
组别n（只）瘤重（g）抑瘤率（%）
空白组51.32±0.110
顺铂组50.58±0.0456.06
DHA低剂量组50.90±0.0931.82
DHA高剂量组50.67±0.0649.24
联合处理组50.33±0.0975.00
2.3 Ang-2的表达情况
Ang-2阳性表达主要位于卵巢癌细胞胞浆内，胞膜及部分基质血管内皮内也有少量着色，细胞核内未见明显的免疫组化阳性信号。本实验采用石蜡切片微波修复抗原程序法（SP法）对Ang-2行多抗免疫组化染色，以PBS液代替一抗作为阴性对照。免疫组化结果参照Fromowitz综合记分法[6]。结果提示：空白组Ang-2的阳性率（82.61%）远高于各处理组（P＜0.05），且联合组最低（7.14%）。
3 讨论
肿瘤由肿瘤细胞和血管两部分构成，肿瘤细胞促进血管的发展，而血管的生成又促进肿瘤的发展，并为肿瘤的转移提供必须的途径[7-8]。Hanahan等[9]研究结果表明，肿瘤血管生成是多种血管生成促进因子和抑制因子之间相互竞争作用的结果，当肿瘤组织释放的血管生成促进因子的作用超过血管生成抑制因子的作用时，启动肿瘤血管生成过程。Ang是近年来新发现的另一类血管生成促进因子，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4[3]，同属于纤维蛋白原超家族。Ang作用于内皮细胞特异性酪氨酸酶受体Tie2与其他血管生成促进因子共同作用，调节血管生长、发育、成熟与稳定[10]。Seval等[11-13]研究结果表明，Ang-1与Tie2受体结合，引起该受体的磷酸化，通过使内皮细胞与周围的内皮细胞紧密结合从而维持和稳定发育成熟的血管；而Ang-2表达于血管重构部位，竞争性抑制Ang-1与Tie2受体结合，不引起该受体的磷酸化，拮抗Ang-1的血管稳定作用，使血管雏形状态向幼稚的、不稳定的血管发展，促使肿瘤血管新生。已有研究证实青蒿素可通过抑制肿瘤细胞VEGF和其受体KDR/flk21的表达，诱导卵巢癌细胞凋亡，减少肿瘤的血管生成，从而抑制肿瘤生长。本实验通过建立人卵巢癌细胞株HO-8910裸鼠移植瘤模型，灌胃给予DHA后观察其对肿瘤生长及肿瘤组织内Ang-2表达的影响，发现所有给药组小鼠体重生长缓慢，肿瘤重量均减小，DHA高剂量组比低剂量组减少明显，且高剂量联合顺铂组减少更明显；同时检测肿瘤组织内Ang-2，发现给药组Ang-2的阳性率均较低，高剂量组和顺铂组比低剂量的低，而联合处理组几乎未见Ang-2。该结果与荷荣荣等[4]研究结果相一致，说明DHA可抑制卵巢癌肿瘤的生长，且成剂量依赖性。另外，Oliner等[14]以Ang-2抗体治疗肿瘤小鼠亦取得了较好的抗瘤效果。
可见，双氢青蒿素不仅可以抑制肿瘤的生长，更可增强化疗药物的生物有效率。其机制可能通过抑制卵巢癌细胞增殖、诱导细胞凋亡和降低侵袭转移能力从而下调Ang-2的表达；另一方面也有可能通过其他通路，比如影响其他血管生成因子如VEGF等的表达，同时反馈调节抑制Ang-2表达，进而调节肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用，减少肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤细胞的转移。这一过程使得药物治疗肿瘤更具有靶向性。
但肿瘤血管生成是一个多步骤多因素的复杂调控过程，血管形成的不同阶段发挥主导作用的调控因素不同，单纯阻断血管形成的某个环节所起到的抑制肿瘤生长的作用是有限的，因此在今后的研究中可以将多种作用机制不同的抑制血管形成的方法联合应用，共同发挥抗肿瘤血管生成的作用。
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（收稿日期：2012-02-08）