摘要鸽疱疹病毒（PiHV1）感染是由I型鸽疱疹病毒引起的以幼鸽为主的一种常见病毒性传染病，临床上以鼻炎、结膜炎为主要特征。偶尔也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。根据已发表的鸽疱疹病毒的基因序列，设计并合成了一对能特异性扩增鸽疱疹病毒的引物，通过对PCR的退火条件的优化，建立了鸽疱疹病毒的PCR检测方法，对发病鸽子进行诊断。并研制出检测试剂盒，再进一步对该试剂盒的敏感性、特异性和稳定性进行了研究，证明该试剂盒具有很高的敏感性和特异性，并且在-20 ℃条件下可保存1年以上。
关键词鸽疱疹病毒；PCR检测；试剂盒
中图分类号S852.65+9.1文献标识码A文章编号 1007-5739（2013）12-0229-02
EstablishPCRDetectionMethodsandDevelopmentKittoPigeonHerpesvirus
XUE MeiZHUANG Lin-linDAI Ding-zhenZHANG Zhi-cheng *
（Department of Animal Science and Technology，Jinling Institute of Technology，Nanjing Jiangsu 210038）
AbstractPigeon herpesvirus infection was a common virus infections disease of the young pigeon caused by type I pigeon herpes virus，clinically，rhinitis and conjunctivitis were the features.Sometimes，the infected pigeons also showed depression，loss of appetite，diarrhea，vomiting and neurological symptoms.According to the published genomic sequence of pigeon herpesviruses，primers for amplification PiHV1specified fragment were designed and PCR assay of annealing for detection PiHV1 was optimized so that could diagnose on the incidence of pigeons.The kit to detect PiHV1 was studied. Then we did a experiments about kit′s sensitivity，specificity and expiration date.The results showed that the kit had high sensitivity and specificity. It also could store at -20 ℃ for at least one year.
Key wordspigeon herpesviruses；PCR detection methods；kit
疱疹病毒（herpesviruses）是群中等小的双股DNA病毒，有100个以上成员，根据其理化性质分α、β、γ 3个亚科。α疱疹病毒（如单纯疱疹病毒、水痘一带状疱疹病毒）增殖速度快，引起细胞病变。β疱疹病毒（如巨细胞病毒）生长周期长，感染细胞形成巨细胞。γ疱疹病毒（如EB病毒），感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。
鸽疱疹病毒感染是由I型鸽疱疹病毒（PiHV1）引起的以幼鸽为主的一种病毒性传染病，临床上以鼻炎、结膜炎为特征。感染鸽子也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。鸽疱疹病毒于1945年由SMADEL首次报道，自1967年以来，英国、前捷克斯洛伐克、澳大利亚、比利时、匈牙利、德国、法国和意大利已分离到该病毒，在美国也发现了该病毒[1]。欧洲的大多数鸽子都受到了感染，50%以上的鸽子有特异性抗体，比利时60%的鸽舍内有此病毒存在，饲养的鸽子患有呼吸性疾病，能够从82有急性鼻炎鸽子的咽内分离出鸽疱疹病毒[2]。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1病料。从浙江、江苏、安徽、山东、上海、福建6个鸽场采取病鸽的135份血清；鸽细环病毒（TTV）阳性病料、鸽腺病毒（FADV）阳性病料，由金陵科技学院预防兽医学教研室保存。
1.1.2试剂。DNA提取试剂盒（Viral nucleic acid extraction kit Ⅱ）；2xTaq Master Mix，南京博尔迪生物科技有限公司生产；Goldview核酸染料，赛百盛公司生产；琼脂糖，北京拜尔迪生物科技有限公司；10xTBE；Marker，南京博尔迪生物科技有限公司。
1.1.3仪器。PCR仪，圣恩国际有限公司制造；电泳槽，北京鑫科奥商贸有限公司；成像系统，厦门亿辰科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取。使用DNA提取试剂盒（Viral nucleic acid extraction kit Ⅱ）进行病毒DNA的提取。具体步骤如下：①在病料中加100 μL超纯水研磨，病料以6 000 r/min转速离心5~10 min，冻融2次。②移取200 μL上清液（血清样品）到1.5 mL EP管中，如果样品不足200 μL，可加PBS缓冲液直至200 μL。加400 μL的VB lysis buffer 到样品中漩涡混匀。在室温下放置10 min。2组对应标记。③放好收集管，将VB column嵌套在上面。加450 μL的AD buffer到样品中混匀。移取上面600 μL的混合液到VB column。以13 000 r/min转速离心1 min。离心后弃去下面的液体，再加上剩下的混合液到同一个VB column中。以13 000 r/min转速离心1 min，倒去收集管中的液体，然后将VB column转移到新的2 mL的收集管中。2组对应标记。④加400 μL的W1 buffer到VB column中，以13 000 r/min转速离心30 s。倒去收集管中的液体。加600 μL的Wash buffer到VB column中，以13 000 r/min转速离心30 s，倒去收集管中的液体，以13 000 r/min转速离心3 min。干燥管壁。⑤将干燥的VB column放到一个干净的1.5 mL的EP管里。加50 μL的无RNA酶水到 VB column膜中心，放置3min或至水被膜完全吸收，以13 000 r/min转速离心1 min。纯化核酸。
1.2.2引物的设计和合成。根据已发表的疱疹病毒的基因序列，利用primer premier 5.0设计引物，由南京英俊公司合成。预期大小约为250 bp。