生物制品中牛病毒性腹泻病毒RT—PCR及套式,RT—PCR检测方法的建立及应用

对照，待细胞出现典型的空泡病变后，收获病毒，用Trizol试剂盒提取病毒基因组及对照细胞的RNA。

1.3RT-PCR反应

1.3.1RT-PCR反应根据已发表的BVDV标准毒株的全序列，设计合成引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：WS-BVDV-F：5′-CTT AGC GAA GGC CGA AAA GAG-3′；WS-BVDV-R：5′-CTC CAT GTG CCA TGT ACA GCA G-3′。

用随机引物同时对样品进行反转录，建立样品的cDNA。PCR扩增反应体系：Takara PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L 上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为312 bp。

1.3.2套式RT-PCR反应根据已发表的BVDV标准毒株的全序列，选择BVDV保守性较强的5′非编码区域，设计合成2对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：BVDV-1 F：5′-TCAGCGAAGGCCGAAAAGAGG-3′；BVDV-1 R：5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGAG-3′；BVDV-1 Fn：5′-CAGTGGCGAGTTCGTTGGATG-3′；BVDV-1 Rn：5′-GGCCTCTGCAGCATCCTATCAG-3′。

用随机引物同时对样品进行反转录，建立样品的cDNA。第1轮PCR扩增反应体系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游、下游引物BVDV-1F、BVDV-1R（10 μmol/L）各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为309 bp。

第2轮PCR扩增反应模板为第1轮PCR产物，反应体系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，第1轮PCR扩增反应产物 1 μL，20 μmol/L上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为197 bp。

1.4PCR特異性试验

分别提取BVDV、CSFV、传染性牛鼻气管炎病毒、MDBK 正常细胞的RNA，用已建立的2种方法进行扩增，验证所建方法的特异性。

1.5检测方法的初步应用

利用所建的套式RT-PCR方法检测血清、疫苗等生物制品，同时对阳性扩增产物进行测序鉴定，进行序列分析。

2结果与分析

2.1扩增产物检测

PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，普通PCR扩增产物位于312 bp，套式PCR第1轮扩增产物位于309 bp（图1），第2轮扩增产物在197 bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符（图2）。

2.2特异性试验

利用设计的普通PCR引物对牛病毒性腹泻病毒进行扩增，扩增产物位于312 bp，猪瘟病毒、MDBK细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未扩增出片段（图3）。利用设计的套式PCR第1轮引物对牛病毒性腹泻病毒扩增除了309 bp的目的基因片段，测序结果与BVDV毒株序列一致，而猪瘟病毒、MDBK 细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未能扩增出片段（图4）。取第1轮PCR产物各1 μL为模板，利用第2轮引物进行扩增，在位于197 bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符，测序鉴定结果与BVDV序列一致，而猪瘟病毒、MDBK细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未扩增出片段（图5）。

2.3检测方法的应用

应用本研究建立的BVDV普通RT-PCR和套式 RT-PCR 检测方法，检测来自不同批次的牛血清和疫苗制品各6份，共计12份样品，检测结果表明，本研究建立的方法能够检测出生物制品中污染BVDV的情况，且套式PCR的检测结果更为灵敏、准确（图6、图7）。

3结论与讨论

小牛血清是生物制品制造过程中不可或缺的原材料，其安全性备受关注。研究表明，细胞培养的生物制品中BVDV

核酸物质污染基本上是由于使用了含有BVDV核酸物质的牛血清引起的。因此在使用牛血清前，尤其是在用于制造人或动物疫苗等生物制品时，应严格检测其是否被BVDV污染[4]。《欧盟生物制品生产牛血清使用指南》要求用细胞培养法和免疫荧光抗体法确认牛血清病毒的感染性[5]。《中国药典》三部附录也对新生牛血清检测提出了相同的技术要求。虽然各国对于牛血清的生产均有严格的技术规范，但由于检测技术存在局限性，市场上还是有部分牛血清存在BVDV污染现象[6]。近2年，我国2次在进口小牛血清中检测到BVDV，发布了2次风险预警，先后禁止新西兰、澳大利亚的相关产品入境。由于BVDV和CSFV存在抗原交叉性，带有BVDV抗原的血清不能用来培养CSFV，而应用BVDV

污染的猪瘟疫苗免疫猪只可能导致其感染BVDV，引起类似于非典型猪瘟的发生。因此科研单位和生物制品企业应该加强对其使用的小牛血清的BVDV检测。

目前，BVDV的检测方法有病毒分离技术、免疫荧光技术、病毒中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等[7]。与病毒分离技术、病毒中和试验等方法相比，RT-PCR技术具有快速高效且特异性强等特点。本研究建立了BVDV的RT-PCR检测方法，同时根据BVDV 5′端非编码区设计2对引物，建立了比常规PCR灵敏度更高的套式RT-PCR方法，为生物制品中微量的BVDV污染提供了一种更加特异、敏感的方法。本方法临床应用结果显示，在随机抽检的疫苗和血清样品中均能检测到被BVDV污染的样品，且套式PCR的检测灵敏度优于普通PCR，表明上述2种方法均能用于检测生物制品中BVDV污染。

参考文献：

[1]祖立闯，王金良，李娇，等. 牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国兽医学报，2010，30（12）：1598-1601，1605.

[2]Peterhans E，Bachofen C，Stalder H，et al. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses （BVDV）：emerging pestiviruses doomed to extinction[J]. Veterinary Research，2010，41（6）：44.

[3]陶洁，廖金虎，张倩，等. 猪感染牛病毒性腹泻病毒研究进展[J]. 中国预防兽医学报，2014，36（5）：410-413.

[4]祖立闯，魏凤，苗立中，等. 应用套式RT-PCR检测猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒污染的研究[J]. 养猪，2011（6）：97-100.

[5]The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal product（CPMP/BWP/1793/02） [M]. London：EMEA，2003：5-7.

[6]王竞晗，李素，何文瑞，等. 进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒的分离及鉴定[J]. 中国生物制品学杂志，2016，29（3）：308-311.

[7]張宁，秦建华，赵博伟，等. 牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展[J]. 动物医学进展，2008，29（2）：93-97.

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