对照组（10 μg TCS）。抗原和佐剂充分混合，免疫途径为背部皮下多点注射，每点50 μL共200 μL注射，初次免疫2 w之后以相同的剂量和途径进行加强免疫，10 d后剪尾取血约200 μL血样于37 ℃静置1 h，4 ℃过夜，第二天3000 r/min离心30 min，取上清即为免疫抗血清，-20 ℃保存备用。
按常规ELISA的方法测定抗血清的效价。参照文献[4]，方法简述如下：96孔板以每孔100 μL抗原TCS（5 μg/mL）于4 ℃包被过夜，PBS-T洗后，每孔加入含有5 %脱脂奶粉的PBS-T（phosphate buffered saline-tween 20）封闭液200 μL，37 ℃湿盒温育1 h。PBS-T洗后，各孔分别加入100 μL按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200稀释的抗血清，阴性对照血清（同批NaCl免疫的小鼠血清）稀释方法相同，37 ℃湿盒温育1 h，用PBS-T洗后，每孔加入1：4000稀释的HRP-IgG，100 μL，37 ℃湿盒温育1 h，洗后每孔加入OPD显色液显色，加入终止液 2 mol/L H2SO4，Bio-Rad 680型酶标仪测定490 nm光吸收值。结果判定以（OD值-空白对照） / （阴性对照-空白对照） 大于2为阳性，小于1.5为阴性，介于2和1.5之间为可疑。
（三）统计学处理
结果以均数±标准差（x ± s ） 表示，数据以非配对t检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
三、结果
以弗氏完全佐剂免疫小鼠的抗血清为阳性对照，检测尿酸钠对小鼠体液免疫应答的影响，结果见图 1和表 1。与单独以TCS免疫诱导的特异性抗体水平相比，尿酸钠为佐剂组TCS诱导的IgG效价明显降低（* P<0.01），提示尿酸钠在一定程度上抑制小鼠的体液免疫。
四、讨论
为了探讨尿酸钠对体液免疫应答的影响，以天花粉蛋白（TCS）为免疫原，在小鼠体液免疫实验中分析了尿酸钠佐剂对特异性抗体应答的作用。研究结果显示，弗氏佐剂能极大地增强TCS特异性抗体应答，而尿酸钠对血清IgG的效价不但没有促进，反而有明显的抑制作用。这一结果提示，尿酸钠对体液免疫作用是抑制性的，但其中的原因尚不清楚。
实验结果表明，尿酸钠不能增强Th2型免疫反应。有研究表明，若同时在实验动物体内注射尿酸和抗原物质时，可诱导出强烈的CD8+ T细胞免疫反应，说明尿酸钠对Th1型免疫应答有促进作用。体外实验发现，尿酸能促进了DC分泌IL-12p70，促进IL-12p70 mRNA的表达。IL-12是DC分泌的重要免疫调节分子，可特异性促进Th1细胞分化而抑制Th2细胞分化，从而诱导特异的Th1细胞免疫应答。这些研究与我们的结果一致，并在一定程度上解释了尿酸钠抑制TCS诱发的抗体应答的原因。
参考文献
[1] Brewer，J.M.，M. Conacher，A.Satoskar，H.Bluethmann，and J.Alexander.In interleukin-4-deficient mice， alum not only generatesT helper 1 responses equivalent to Freund s complete adjuvant， but continues to induce T helper 2 cytokine production[J].Eur.J.Immunol. 1996，26：2062–2066 .
[2] Mirjam Kool， Thomas Soullié， Menno van Nimwegen， et al.Alum adjuvant boosts adaptive immunityby inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells [J]. J of Experimental Medicine Immunol. 2008， 205， （ 4） 869-882.
[3] Eisenbarth SC， Flavell RA. Innate instruction of adaptive immunity revisited：the inflammasome [J]. EMBO Mol Med. 2009， 1（1）： 92–98.
[4] Shi Y， Evans JE， Rock KL. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cell [J]. Nature，2003，425（2）：516–521.
[5] Zhang J S，Liu W Y.The mechanism of action of trichosanthin on eukaryotic ribosomes RNA N-glycosidase activity of the cytotoxin[J].Nucleic Acids Res.1992，20（6）： 1271-1275.
[6] Li M X，Yeung H W，Pan L P，et al.Trichosanthin，a potent HIV-1 inhibitor，can cleave supercoiled DNA in vitro[J].Nucleic Acids Res. 1991， 19（22）：6309-6312.
[7] 安群星，徐志凯，黎志东，等.研究报告具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白TCSYFF-KR的构建及原核表达[J].现代免疫学，2006；17（2）：167-170
[8] 安群星，贾宁，张献清，等.具有抗HIV活性的天花粉蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化[J] .现代免疫学，2008；19（1）： 5-11
[9] Brewer， J.M. ， M. Conacher ， C.A. Hunter ， M. Mohrs， F. Brombacher ，and J. Alexander . Aluminium hydroxide adjuvant initiates strong antigen-specifi c Th2 responses in the absence of IL-4- or IL-13-mediated signaling. [J]. J Immunol.1999. 163（1）：6448-6454 .
[10] Wijburg ， O.L. ， G.P. van den Dobbelsteen ， J. Vadolas， A. Sanders ， R.A.Strugnell ， and N. van Rooijen . The role of macrophages in the induction and regulation of immunity elicited by exogenous antigens [J]. Eur. J. Immunol. 1998，28（12）：479- 487.
[11] Brewer， JM， M. Conacher， M. Ganey， M. Douglas， H. Bluethmann， and J. Alexander . Neither interleukin-6 nor signalling via tumour necrosis factor receptor-1 contribute to the adjuvant activity of Alum and Freund’s adjuvant. [J]. Immunology.1998，93（2）：41-48.
[12] Mannhalter，J.W. ，H.O.Neychev，G.J.Zlabinger，R.Ahmad ，and M.M.Eibl. Modulation of the human immune response by the non-toxic and non-pyrogenic adjuvant aluminium hydroxide： effect on antigen uptake and antigen presentation [J].Clin.Exp.Immunol.1985，61（3）.
基金项目：本文系韶关市科技局卫生局免疫学教学、D-二聚体的部分研究成果，课题编号：2013Y13100。
作者简介：刘春永（1986- ），男，河南洛阳人，硕士，讲师，研究方向：免疫调节和免疫药理。