摘要：目的 观察抗纤灵对5/6肾切除大鼠骨髓来源的成纤维细胞表型转化的影响，探讨其抗肾纤维化的作用机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组和造模组，造模组以5/6肾切除方法建立慢性肾衰竭动物模型，1周后按血肌酐水平将造模大鼠分为模型组、福辛普利组和抗纤灵组。各给药组给予相应药物灌胃，模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃，8周后采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法测定各组大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原和CD45基因及蛋白的表达。结果 模型组大鼠表达α-SMA mRNA、Ⅰ型胶原mRNA和CD45 mRNA水平较假手术组明显升高（P<0.001或P<0.05），抗纤灵组与模型组比较均明显下降（P<0.01或P<0.05）；模型组大鼠表达α-SMA、Ⅰ型胶原和CD45蛋白水平较假手术组明显升高（P<0.001），抗纤灵组与模型组比较均显著下降（P<0.001）。结论 抗纤灵可降低Ⅰ型胶原和CD45的表达，抑制骨髓来源的成纤维细胞表型转化，从而延缓肾纤维化进程，保护残肾功能。
关键词：抗纤灵；α-平滑肌肌动蛋白；Ⅰ型胶原；CD45蛋白；表型转化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0033-03
肾纤维化是各种原因引起的慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）进展到慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）的共同途径和主要病理基础。肾纤维化包括肾小球硬化和肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF），且RIF较肾小球病变在CKD进展中的意义更加重要[1]。但无论肾间质，还是肾小管、肾小球，它们在纤维化过程中都涉及到炎性因子、生长因子和黏附分子等多种活性物质诱导肾间质成纤维细胞（fibroblast，FBS）、肾小管上皮细胞或肾小球系膜细胞等肾脏固有细胞发生表型转化，使之转化为α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF）[2]。MyoF具有很强的增殖能力，可合成Ⅰ型胶原（CollagenⅠ），分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM），并抑制ECM降解，使ECM过度积聚，在肾纤维化的发展中有重要的作用[3]。肾间质FBS的活化在RIF形成过程中具有极其重要的作用，其来源可能有以下几个方面：肾间质固有的FBS、骨髓的造血干细胞或间质干细胞、由上皮细胞转分化而来的FBS等[4-5]。本研究通过测定骨髓来源的FBS标记物CollagenⅠ和CD45分子，观察抗纤灵对5/6肾切除大鼠骨髓来源的FBS的表型转化，阐明其抗肾纤维化的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
健康SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪） 2008-0016。实验期间自由饮水，摄食饲料由上海中医药大学动物实验中心提供，适应性喂养1周后进行实验。室温20～24 ℃，相对湿度45 ℃。
1.2 药物与试剂
抗纤灵（丹参30 g，制大黄15 g，桃仁15 g，全当归15 g，牛膝15 g），上海中医药大学附属曙光医院制剂室提供，批号110523。福辛普利（商品名：蒙诺，10 mg/片），中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号110616。兔抗大鼠Collagen Ⅰ抗体（产品编号ab292）、兔抗大鼠α-SMA抗体（产品编号ab5694）、羊抗兔二抗（产品编号ab6721）均购自Abcam公司；小鼠抗大鼠CD45抗体（产品编号sc53047）、羊抗小鼠二抗（产品编号sc3738）、β-actin（产品编号sc47778）均购自Santa Cruz公司；ECL显影液（产品编号WBKLS0500），购自Millipore公司；胶片购自柯达公司；Trizol法总RNA抽提试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均由BioTNT公司提供。
1.3 造模
参考文献[6]方法，大鼠以2%戊巴比妥钠按40 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，备皮，用75%酒精消毒手术区后铺巾，距左脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，经后腹膜取肾，暴露肾脏，分离肾周脂肪及包膜后，弧型切除2/3肾组织（主要切除皮质部分）约0.6 g，用明胶海绵压迫止血片刻，再滴加数滴纤维蛋白原和凝血酶溶液，稍等片刻，当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾，缝合；1周后再次手术切除整个右肾。另取正常SD大鼠10只，仅作背部切口，分两次剥离左右肾包膜，保留肾上腺，作为假手术组。
1.4 分组
大鼠适应性饲养1周后，随机取10只为假手术组，其余30只为造模组，将造模组大鼠按上述方法制作CRF动物模型，术后1周目内眦采血，测定肾功能，根据血肌酐（SCr）随机分为模型组、福辛普利组、抗纤灵组，每组10只。
1.5 给药
抗纤灵制成每1 mL含3.2 g原药材的水煎剂，用量按临床成人每千克体质量用量的20倍折算，即按23 g/（kg·d）给大鼠灌胃，连续8周。福辛普利制成每毫升含0.5 mg药物的水溶液，用量按临床成人每千克体质量用量的20倍折算，即按3.3 mg/（kg·d）给大鼠灌胃，连续8周。假手术组和模型组给予同体积生理盐水灌胃，连续8周。
1.6 取材
治疗8周后处死大鼠，取出肾组织，于液氮中速冻后，置-80 ℃冰箱保存待测。
1.7 指标测定
1.7.1 α-平滑肌肌动蛋白 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA和CD45 mRNA的表达检测 采用RT-PCR法。按照Genbank数据库中公开发表的基因序列，采用Primer Express引物设计软件，分别设计了α-SMA、CollagenⅠ和CD45的引物。步骤如下：采用Trizol法总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA；提取出的mRNA进行反转录，成为cDNA模板；以cDNA为模板，进行real time PCR实验。引物序列：α-SMA 5"CCGAGATCTCACCGACTACC3"（上游引物），5"TCCAGAGCGACATAGCACAG3"（下游引物），120 bp；Collagen Ⅰ 5"CGTGGAAACCTGATGTATGCT3"（上游引物），5"ACT CCTATGACTTCTGCGTCTG3"（下游引物），172 bp；CD45 5"AATACC ACCACAAGCACAG3"（上游引物），5"TCATAGATGTAACGCACAGT3" （下游引物），92 bp；内参（β-actin）5"CCTCTATGC CAACACAGT3" （上游引物），5"AGCCACCAATCCACACAG3"（下游引物），156 bp。扩增条件：95 ℃变性5 min，然后95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s循环40次。程序运行结束后，分析各基因的实时扩增曲线和熔解曲线。取CT值（扩增动力曲线拐点），按2-△△CT[7]法计算待测目的基因相对表达量。
1.7.2 α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原和CD45蛋白的表达检测 采用Western Blotting法。步骤如下：切取新鲜冻存肾组织，匀浆器充分研磨、匀浆，加入RIPA buffer蛋白裂解液，4 ℃，14 000 r/min离心15 min，提取肾组织细胞浆蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。在10%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电压60 V、30 min，80 V、90 min。室温恒压100 V 转膜60 min，分离蛋白，使之转移至PVDF膜上，用TBS缓冲液洗膜5 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，按1∶3 000加入α-SMA和CollagenⅠ第一抗体，1∶2 000加入CD45第一抗体，1∶5 000加内参β-actin抗体，4 ℃摇床轻摇过夜。去一抗，TBST缓冲液洗3次，每次5 min，再加入相应辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶10 000），室温孵育1 h，TBST缓冲液洗3次，每次5 min。ECL试剂显色并曝光成像，凝胶成像系统成像，用Bio Rad quanity one软件对条带进行半定量分析，CollagenⅠ、α-SMA和CD45蛋白质相对含量分别用其与β-actin特异性条带的积分光密度之比值表示。
1.8 统计学方法
应用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料用—x±s表示，组间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果（见表1、表2、图1）
3 讨论
CD45是单链跨膜糖蛋白，是一种白细胞共同抗原（leukocyte common antigen，LCA），是蛋白酪氨酸磷酸，广泛分布于髓系和淋巴系前体细胞及淋巴结中的成熟细胞表面，在90%以上的急性髓细胞白血病、大多数急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤患者中亦有表达，但成熟红细胞与血小板不表达。CD45分子有9种异构体，根据细胞类型、细胞分化程度而分布不同。异构体的差异由细胞外区域决定，是同一基因的4～6个外显子交替剪接而成，也提示胞外区域可以通过与特异性配基结合而参与蛋白-蛋白间相互作用[8]。CD45所有异构体在体外显示酶活性，T、B细胞系和NK细胞受刺激后的信号传导过程均需要CD45分子的参与[9]。CD45分子在造血细胞的生长发育、活化及凋亡过程中担负重要的调控作用[10]。
肾间质FBS表达α-SMA标志着具有MyoF特性，即发生了细胞表型转化。因此，α-SMA是肾间质FBS表型转化的特异性标志蛋白之一。无论原发疾病如何，在RIF发生发展过程中，α-SMA阳性的MyoF是导致病理条件下肾间质中ECM过度沉积的主要细胞来源。α-SMA作为MyoF的特异性标志物与肾小管间质损伤程度密切相关，并对RIF和肾功能损害具有潜在的预测价值。研究表明，肾间质α-SMA阳性的MyoF中，有32%来源于骨髓[11]。这些骨髓源性FBS可浸润到缺血后的肾间质，参与ECM的合成。Sakai N等[12]在单侧输尿管结扎（UUO）小鼠进展性肾纤维化模型中，可见肾间质CD45和CollagenⅠ双阳性（CD45+/CollagenⅠ+）的FBS浸润，皮髓交界区更为明显。浸润的FBS数目随着纤维化的进展而增加，在输尿管结扎后的第7日达到顶峰。
本研究通过测定FBS标记物（Collagen Ⅰ+/CD45+）来观察骨髓来源的FBS向MyoF的表型转化，结果显示5/6肾切除模型大鼠表达Collagen ⅠmRNA、α-SMA mRNA和CD45 mRNA明显增加， Collagen Ⅰ、α-SMA和CD45蛋白表达亦明显升高，抗纤灵和福辛普利可显著抑制其表达。表明抗纤灵可从基因和蛋白两个水平，有效降低骨髓来源的FBS α-SMA的表达，抑制其表型转化，减少MyoF在肾间质的积聚和Collagen Ⅰ的沉积，通过这一效应延缓CRF大鼠肾纤维化进程，保护残肾功能。
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（收稿日期：2012-04-08，编辑：华强）