中圖分类号 R285.6 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）07-0936-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.18
摘 要 目的：考察虎杖苷对肾纤维化模型大鼠肾组织中基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）蛋白表达的影响，探讨其延缓大鼠肾纤维化的作用机制。方法：将40只大鼠随机分为假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、虎杖苷组（100 mg/kg）和贝那普利组（阳性对照，5 mg/kg）。除假手术组外，其余各组大鼠均采用单侧输尿管梗阻法制备肾纤维化大鼠模型。术后1 h，各组大鼠灌胃相应药物，每天给药1次。连续给药4周后，检测各组大鼠尿液中β2微球蛋白（β2-MG）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）含量和血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量；苏木素-伊红染色观察大鼠肾组织病理改变，并进行评分；免疫组织化学法检测大鼠肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠尿液中β2-MG、NAG含量和血清中BUN、Cr含量均显著升高（P<0.05），并且大鼠肾组织的病理评分和组织中MMP-9、TIMP-1蛋白的表达水平也显著升高（P<0.01）。与模型组比较，虎杖苷组和贝那普利组大鼠肾组织中MMP-9蛋白表达水平持续增高（P<0.01），其余各指标水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）；且虎杖苷组与贝那普利组比较大鼠各指标水平差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：虎杖苷延缓大鼠肾纤维化进程的机制可能与上调大鼠肾组织中MMP-9蛋白表达和下调TIMP-1蛋白表达，升高MMP-9/TIMP-1的比值有关。
关键词 虎杖苷；肾纤维化；单侧输尿管梗阻；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶组织抑制物1
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of polydatin on protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in renal tissue of renal fibrosis model rats， and to investigate the mechanism of delaying renal fibrosis in rats. METHODS： A total of 40 rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， polydatin group （100 mg/kg） and benazepril group （positive control， 5 mg/kg）. Except for sham operation group， renal fibrosis rat model was induced by unilateral ureteral obstruction in other groups. 1 h after surgery， each group was given relevant medicine intragastrically， once a day. After 4 weeks of consecutive treatment， the contents of β2-microglobulin （β2-MG） and N-acetyl-β-D-glucosaminidase （NAG） in urine， serum contents of BUN and Cr were detected in each group. HE staining was used to observe and score pathological changes of renal tissue in rats. Protein expressions of MMP-9 and TIMP-1 in renal tissue of rats were determined by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with sham operation group， the contents of β2-MG and NAG in urine， serum contents of BUN and Cr were increased significantly in model group （P<0.05）， and pathological score and protein expressions of MMP-9 and TIMP-1 were also increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， protein expression of MMP-9 in renal tissue were increased continuously in polydatin group and benazepril group （P<0.01）； other indexes were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and there was no statistical significance in each index between polydatin group and benazepril group （P>0.05）. CONCLUSIONS： Polydatin can delay renal fibrosis， the mechanism of which may be associated with up-regulating protein expression of MMP-9， down-regulating protein expression of TIMP-1 and increasing the ratio of MMP-9/TIMP-1.
KEYWORDS Polydatin； Renal fibrosis； Unilateral ureteral obstruction； MMP-9； TIMP-1
肾纤维化是指细胞外基质在肾小管间质中的异常沉积，是所有慢性肾病发展到终末期肾功能衰竭的共同途径以及终末期肾病的共同病理特点[1-2]。其病变过程非常复杂，多种细胞、细胞因子、血管活性物质和细胞外基质等诸多因素相互作用，使细胞外基质产生增多或降解减少，最终导致代谢失衡[3]。虎杖苷是从蓼科植物虎杖的干燥根茎中提取的一种单体化合物，又称白藜芦醇苷，具有抗炎、调节免疫、改善糖脂代谢、保护脏器以及治疗心血管疾病等作用[4]。有研究显示，虎杖苷对缺氧复氧肾小管上皮细胞损伤具有保护作用[5]，且能够通过抑制氧化应激对糖尿病肾病造成的肾小管损伤产生保护作用[6]。这些研究结果提示虎杖苷对肾疾病具有很好的保护作用。笔者前期研究也显示，虎杖苷可延缓肾纤维化模型大鼠肾间质纤维化的发生发展[7]。然而，其作用机制不完全清楚。基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）是调节细胞外基质代谢的重要酶系[8]，二者功能紊乱或调节异常参与了肾间质纤维化的病变过程。本研究拟通过观察虎杖苷对肾纤维化模型大鼠肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白的表达，进一步探讨虎杖苷延缓大鼠肾纤维化的作用。
1 材料
1.1 仪器
7600型全自动生化分析仪（日本日立公司）；168- 1000xc型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；BX50型光学显微镜（日本Olympus株式會社）；Lecia型显微照像系统（德国Leica公司）。
1.2 药品与试剂
虎杖苷对照品（南京青泽医药科技开发有限公司，批号：20141106，纯度：≥98%）；盐酸贝那普利片（北京诺华制药有限公司，批号：X2608，规格：10 mg/片）；尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）测定试剂盒（罗氏诊断有限公司，批号：29646301、28332601）；大鼠β2微球蛋白（β2-MG）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）酶联免疫吸附 （ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：I21137666、J03137667）；所有抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯。
1.3 动物
健康SD大鼠40只，♂，清洁级，鼠龄6周，体质量（200±20） g，由河南省实验动物中心提供[动物生产合格证号：SCXK（豫）2011-0001]。
2 方法
2.1 分组与造模
将40只大鼠随机分为4组，即假手术组、模型组、虎杖苷组和贝那普利组，每组10只。模型组、虎杖苷组和贝那普利组大鼠采用单侧输尿管梗阻（UUO）法[9]复制肾纤维化模型，即用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，常规备皮消毒，然后于左侧中腹切开皮肤，逐层分离皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露并游离左侧输尿管，在输尿管上1/3处和中1/3处分别用丝线结扎输尿管，再在两结扎点之间剪断输尿管，最后逐层缝合。假手术组大鼠仅打开腹腔和游离左侧输尿管，不结扎、不切断。
2.2 给药
手术完成后1 h开始给药，虎杖苷组大鼠灌胃虎杖苷100 mg/kg （预实验结果显示，100 mg/kg为改善肾纤维模型大鼠肾功能的最佳剂量），贝那普利组大鼠灌胃给予5 mg/kg贝那普利（生理盐水溶解，根据成人临床用量换算而得），模型组和假手术组大鼠灌胃等体积的生理盐水。每天给药1此，连续给药4周。
2.3 标本采集及处理
末次灌胃后将大鼠置于洁净代谢笼内，收集24 h尿液。24 h后将所有大鼠麻醉，眼眶后静脉丛取血2 mL，以离心半径15 cm、3 000 r/min离心15 min，取上清液。处死大鼠后取出输尿管结扎侧的肾组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 ℃冰箱中保存，备用。
2.4 尿液中β2-MG和NAG含量测定
采用双抗夹心ELISA法，按照试剂盒说明书操作测定各组大鼠尿液中β2-MG和NAG的含量。
2.5 血清中BUN和Cr含量检测
采用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中BUN和Cr含量。
2.6 肾组织病理评分
将蜡块制成4 μm厚的切片，行苏木精-伊红（HE）染色，然后于光学显微镜下观察其病理变化，并按照Banff分级进行评分[10]：0分表示肾组织无肾小管扩张、萎缩、坏死等病理变化；1分表示轻度损伤，即肾小管间质病变范围<25%；2分表示中度损伤，即肾小管间质病变范围为26%～50%；3分表示严重损伤，即肾小管间质病变范围>50%。每只大鼠取3张切片，每张切片随机选取5个高倍视野（×400）。
2.7 肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白表达测定
取石蜡切片，采用生物素蛋白-过氧化物酶（SP）免疫组织化学法进行测定。切片常规脱蜡水化，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3遍，柠檬酸抗原修复10 min，自然冷却，PBS漂洗3遍，用含3%H2O2的去离子水室温孵育20 min，PBS漂洗3遍，滴加封闭用正常山羊血清工作液，37 ℃孵育20 min，弃去多余液体；然后滴加MMP-9、TIMP-1一抗（1 ∶ 150），4 ℃过夜，PBS漂洗3遍；然后滴加山羊抗兔二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍；3，3′ -二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，显微镜下控制显色时间（2～3 min），苏木素复染5 min，盐酸乙醇分化，自来水充分冲洗，脱水、透明、封片、镜检。以胞浆呈棕黄色为阳性表达，用Biosens Digital Imaging System v1.6图像分析软件测定每个高倍视野（×400）下阳性染色细胞的平均积分光密度值。
2.8 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 尿液中β2-MG和NAG含量测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠尿液中β2-MG和NAG含量显著升高（P<0.01）。与模型组比较，虎杖苷组和贝那普利组大鼠尿液中β2-MG和NAG含量均显著降低（P<0.05），且虎杖苷组与贝那普利组大鼠尿液中β2-MG和NAG含量差异无统计学意义（P>0.05），结果见表1。
3.2 血清中BUN和Cr含量测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠血清中BUN和Cr含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，虎杖苷组和贝那普利组大鼠血清中BUN和Cr含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），且虎杖苷组与贝那普利组大鼠血清中BUN和Cr含量差异无统计学意义（P>0.05），结果见表2。
3.3 肾组织病理评分结果
与假手术组比较，模型组大鼠肾组织病理评分显著升高（P<0.01）。与模型组比较，虎杖苷组和贝那普利组大鼠肾组织病理评分显著降低（P<0.01），且虎杖苷组和贝那普利组大鼠肾组织病理评分差异无统计学意义（P>0.05）。假手术组、模型组、虎杖苷组和贝那普利组大鼠肾组织病理评分依次为0.07±0.15、1.99±0.44、1.31±0.41、1.25±0.31（n=10）。
3.4 肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白表达测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，虎杖苷组和贝那普利组大鼠肾组织中MMP-9蛋白表达水平持续升高（P<0.01），而TIMP-1蛋白表达水平则显著降低（P<0.05）；但虎杖苷组与贝那普利组大鼠肾组织中MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），免疫组化图见图1，测定结果见表3。
4 讨论
UUO动物模型通过结扎单侧输尿管，阻塞肾脏引流系统，从而引起肾功能急性改变以及肾结构慢性损伤，其结果与梗阻性肾病患者的观察结果相似[11]，是一种研究肾纤维化发病机制、肾细胞转分化和评价肾纤维化治疗方法的理想模型。在本研究中，HE染色后可见模型组大鼠肾间质区域有大量胶原纤维沉积，肾间质纤维化明显，肾组织病理评分显著高于正常組，这个结果与大鼠血清中BUN和Cr含量显著升高相对应，提示造模成功。给予虎杖苷后，大鼠肾间质纤维化程度减轻，病理评分和血清中BUN、Cr含量较模型组大鼠均显著降低，且与贝那普利组大鼠比较差异无统计学意义。贝那普利是经典的血管紧张素转化酶抑制剂，其可延缓人及动物模型的肾小球硬化和小管间质纤维化进展的作用已得到广泛公认[12]，故在本研究中以其为阳性对照药。
β2-MG作为一种小分子球蛋白，在正常人体内的生成和释放速度十分恒定，并且能自由通过肾小球滤过膜，原尿中99.9%的β2-MG被近曲小管重吸收和降解，因此正常人体尿液中β2-MG含量极低[13]。一旦肾小管功能受到轻微损伤，对β2-MG的重吸收功能下降，便可引起尿液中β2-MG含量的增高。尿液中β2-MG已被视为肾小管经典标记蛋白，与肾小管功能紧密相连[14]。NAG是位于溶酶体中的一种酸性水解酶，肾组织是合成和储存NAG的主要器官，尤其以肾组织的近曲小管内含量最多，由于血浆中的NAG不能被肾小球滤过，NAG都是从尿中直接排出。正常尿液中NAG的含量保持恒定，但当缺血、缺氧、中毒等多种因素引起近曲小管功能被破坏时，尿液中NAG含量将显著升高，这预示着近曲小管上皮细胞受损，溶酶体破裂释放了NAG。因此，尿液中NAG含量是监测早期肾损伤与病程观察的敏感且特异的指标[15]。在本研究中，模型组大鼠尿液中β2-MG和NAG含量较假手术组均显著升高，而虎杖苷组大鼠尿液中β2-MG和NAG含量较模型组显著降低，且与贝那普利组大鼠比较差异无统计学意义。
MMPs是一类高度保守的依赖于锌离子和钙离子的内切蛋白水解酶家族，能降解纤维连接蛋白、粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等构成细胞外基质的多种成分[16]。MMP-9又称明胶酶，是调节细胞外基质动态平衡的重要酶类，主要在肾小球、近曲小管、髓袢、集合管表达[16]，主要降解明胶、Ⅳ和Ⅴ型胶原及层粘连蛋白等，是细胞外基质蛋白降解酶之一，能够降解完整的基底膜[17]。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，在肾间质纤维化过程中，细胞外基质的过度累及与MMPs/TIMPs的比例失衡有关[16]。在肾间质纤维化过程中，TIMP-1过度表达，通过抑制MMP-9活性使MMP-9失去降解细胞外基质的能力，造成细胞外基质过度堆积，最终因MMP-9/TIMP-1比例失衡而导致肾纤维化[18]。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织中MMP-9蛋白表达水平升高；经虎杖苷治疗后大鼠肾组织中MMP-9蛋白表达水平没有出现下降趋势，而是维持在较高水平，但是TIMP-1蛋白的表达水平较模型组显著降低。相关研究认为，MMPs具有双重作用，既可以作为抗纤维化的酶又是前炎症介质，在肾病中具体发挥哪种作用取决于MMPs的净活性和发病的急缓[19]。邓顺有等[20]认为通过调控MMPs/TIMPs系统，上调MMPs蛋白表达，下调TIMPs蛋白表达，升高MMPs/TIMPs比值，能够促进细胞外基质降解。总之，肾组织中MMP-9蛋白表达水平升高，将有助于清除产生过多的细胞外基质，是肾纤维化的一种自身抑制反应；而TIMP-1蛋白表达水平升高则可拮抗MMP-9的活性，导致细胞外基质降解减少。
综上所述，虎杖苷可通过上调肾组织中MMP-9蛋白的表达，同时下调肾组织中TIMP-1蛋白的表达，使MMP-9/TIMP-1的失衡状态得以恢复，从而使过度沉积的细胞外基质降解，进而延缓肾纤维化的进程，本研究结果为中药防治肾纤维化提供了新的思路。
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（收稿日期：2017-09-06 修回日期：2018-01-30）
（编辑：林 静）