摘要：烟草花叶病毒属病毒可侵染多种植物，给农业生产带来严重危害。为建立该病毒属的条形码鉴定技术，以该属22个确定种的标准序列为凭证标本序列，分析其保守区域，设计6对候选条形码引物（Tobamo1-Tobamo6），其扩增片段长度为200～1 240 bp。以田间样本对引物进行筛选，通过比较各引物的扩增效率、测序成功率、获得序列的亲缘关系对引物的通用性和物种分辨率进行评价。结果表明，Tobamo6的通用性最高，扩增率和测序成功率均为100%；物种分辨率良好，获得序列的种内种间变异可有效鉴定实际样本中的辣椒轻斑驳病毒、烟草花叶病毒、番茄花叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒；可作为烟草花叶病毒属的首选条形码引物。
关键词：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）；条形码技术；鉴定
中图分类号：S463.85 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2624-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.016
Development of Barcoding Technique for Identification of the Genus Tobamovirus
ZHANG Yong-jiang1，MA Rong-qun2，XIN Yan-yan1，HUANG Yue2
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100029， China； 2.Qingdao Institute of Agricultural Science Research， Qingdao 266100， Shandong， China）
Abstract： Plant viruses of Tobamovirus can infect many plants and is one of the most devastating threats to agricultural production. To develop barcoding technique for identification of genus Tobamovirus， the standard nucleotide sequences of twenty-two type species used as voucher specimen were analyzed by using the software Omiga 2.0， and six pair candidate barcoding primers Tobamo1-Tobamo6 were designed， which amplified 200～1 240 bp bands. These primers were tested by using field samples. Their universality and species resolution were compared during RT-PCR amplification rate， sequencing success rate and sequence phylogenetic relationship. The results demonstrated that Tobamo6 had the highest universality with 100% PCR amplification rate and sequencing success rate； and better species resolution， which can successfully identify four Tobamovirus viruses including Cucumber green mottle mosaic virus，Pepper mild mottle virus，Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus from field samples. All this suggested Tobamo6 as the primary barcode for the identification of Tobamovirus viruses.
Key words： Tobamovirus； barcoding technique； identification
烟草花叶病毒属（Tobamovirus）为芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales）帚状病毒科（Virgaviridae）成员；根据国际病毒分类委员会（International Committeeon Taxonomy of Viruses， ICTV）于2012年发布的最新病毒分类第九次报告，该病毒属包含曼陀罗轻斑驳病毒（Brugmansia mild mottle virus， BrMMV）等25个确定种和苘麻黄花叶病毒（Abutilon yellow mosaic virus， AbYMV）、甜椒斑驳病毒（Bell pepper mottle virus， BPMoV）、仙人掌轻斑驳病毒（Cactus mild mottle virus， CMMoV）、黄瓜斑驳病毒（Cucumber mottle virus， CuMoV）、鸡蛋果花叶病毒（Maracuja mosaic virus， MarMV）及Tropical soda apple mosaic virus （TSAMV）等6个暂定种[1]。同时，该属内新的病毒种类还有增加的趋势；而且该属病毒的寄主范围相当广泛，给农业生产带来重大损失；因此，加强对该属病毒的检测鉴定具有重要意义[2]。国内外采用直接观测法、电镜法、生物学测定法、血清学检测及分子生物学检测等方法[3]对该属病毒进行鉴定研究。随着各地植物种质资源的引进和栽培条件的改变，对该属病毒的检测鉴定方法也提出了更高的要求。
生物条形码技术是近年来出现的一种新的生物物种检测鉴定技术，由加拿大Guelph大学的分类学家Paul Hebert在2003年首次提出，其在物种标准化鉴定方面的优势已备受关注[4-6]。该技术利用基因组中一段通用的标准短序列对物种进行鉴定。目前，动物种类鉴定中广泛使用的是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因；植物上选定的是叶绿体rbcL和matK基因；真菌学家则以ITS作为真菌的首选条形码[7]。在植物病毒方面，尚未有开展生物条形码技术的研究，本试验以烟草花叶病毒属病毒为研究对象，初步筛选评价适于该属病毒检测鉴定的生物条形码。
1 材料与方法
1.1 材料
样品：花叶症状明显的西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草及黄瓜等样品采自山东省青岛市田间，保存于-80 ℃冰箱，用作条形码引物验证的样本。
试剂：RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒购自原平皓生物公司，Transcriptor cDNA Synth试剂盒购自罗氏公司，PCR master mix为MBI产品，DL2 000分子量标准购自大连宝生物生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 条形码引物设计
以Genbank中烟草花叶病毒属22个病毒的代表种作为病毒的凭证标本（表1），分析其序列保守区域，根据条形码引物设计的条件即扩增片段长度、扩增片段种内的保守性和种间的变异性设计候选条形码引物，具体引物信息见表2。
1.3 总RNA提取与RT-PCR扩增
分别称取样品0.1 g，按照总RNA提取试剂盒步骤提取各样品的总RNA。测定浓度后，以总RNA为模板，按照Transcriptor cDNA Synth试剂盒说明进行第一链cDNA合成。以合成的cDNA为模板，分别使用上述引物，根据PCR master mix产品说明进行PCR扩增，反应条件见表2。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测后送上海生工生物公司测序。
1.4 测序及数据分析
采用Omiga（version 2.0）软件对测得序列进行校对拼接；利用DNAMAN（version 4.0）软件，采用Kimura-2-parameter distance （K2P）模型计算各序列的种内和种间遗传距离，评价各条形码候选片段。
2 结果与分析
2.1 条形码引物通用性评价
通过分析ICTV第九次报告中烟草花叶病毒属确定种的代表序列，根据引物设计条件，设计6对候选条形码引物。PCR扩增效率是评价条形码技术的重要标准。以提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，验证6对引物的扩增效率。Tobamo1的效率最低，在所有样品中均无扩增；Tobamo2、Tobamo3、Tobamo4和Tobamo5的效率次之，只在部分样品中扩增到预期大小的产物（电泳结果未显示）；Tobamo6的效率最高，为100%，在所有测试样品中均扩增出一条清晰的约200 bp的条带（图1）。
PCR产物的测序成功率是评价条形码引物的另一个重要标准。6对引物中，Tobamo4、Tobamo5和Tobamo6的测序成功率均为100%（表3）。综合PCR扩增效率和测序成功率，6对候选条形码引物中以Tobamo6的效果最好，可将其作为烟草花叶属病毒检测鉴定的首选条形码。
2.2 条形码引物物种分辨率评价
将烟草花叶病毒属凭证标本序列和Tobamo6的PCR扩增产物序列构建邻接树，分析病毒种之间的亲缘关系，确定条码序列在病毒种类鉴定分类中的效果（图2）。Tobamo6在辣椒和南瓜样品中扩增到的4个辣椒轻斑驳病毒分离物（PMMoV-SD1、 -SD3、-SD8、-SD9）与代表分离物-S聚为PMMoV簇；在西瓜中扩增到的黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物（CGMMV-SD）与其代表分离物-SH聚为CGMMV簇；在烟草和黄瓜上检测到的3个烟草花叶病毒分离物（TMV-SD3、-SD4、-SD5）與其代表分离物聚为TMV簇；而番茄和芸豆上的4个番茄花叶病毒分离物（ToMV-SD1、-SD2、-SD3、-SD4）聚为ToMV簇；同时这4个簇与其他病毒种都明显区分开。上述结果表明，Tobamo6从表现病毒症状的不同样品中获得的同种病毒分离物的序列在种内变异足够小，可以通过聚类确认为同一个病毒种；并且这些同种病毒分离物与不同病毒种的种间变异足够大，能够有效区分不同的病毒种；说明该对条码引物在烟草花叶病毒属中具有良好的物种分辨率。
将测定序列在NCBI中进行序列比对，结果显示分别为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒和番茄花叶病毒（表4），比对结果与系统进化树分析结果一致，进一步证明了Tobamo6具有良好的物种分辨率。
3 小结与讨论
烟草花叶病毒属病毒的寄主范围非常广，可侵染的植物达150多个属，主要是一些草本双子叶植物，包括蔬菜、花卉和烟草等，给这些作物的种植带来严重危害。国内不少学者分别针对不同的烟草花叶病毒属病毒进行检测技术的研究，罗朝鹏[8]、郭京泽等[9]分别就烟草花叶病毒和辣椒轻斑驳病毒进行了RT-PCR检测技术探讨。生物条形码技术的研究可对烟草花叶病毒属内的所有病毒进行有效的检测鉴定，该技术的推广应用将极大提高口岸标本检测的效率和货品的通关速度。
通常在物种识别中长序列比短序列的识别率高，在关系密切的类群中，增加序列信息能够增加解析度[10]。然而，当样本质量不高，存在RNA降解情况时，常常难以获得完整的生物条形码信息，相对而言，约200 bp的微型生物条形码的序列更易于扩增获得。范京安等[11]以果实蝇物种鉴定的虚拟试验和实体试验表明，微型生物条形码鉴定果实蝇物种的准确性与生物条形码基本一致，均可作为果实蝇物种鉴定的有效依据。本研究表明，约200 bp的候选片段Tobamo6的扩增效率和测序成功率均明显优于其他长片段的条形码，可考虑将其作为植物烟草花叶病毒属病毒检测的首选条形码。由于试验材料的局限，还应加大样本量，进一步检验该条形码在烟草花叶病毒属其他病毒检测中的适用性。
参考文献：
[1] KING A M，LEFKOWITZ E，ADAMS M J，et al.Virus taxonomy： ninth report of the international committee on taxonomy of viruses[M]. Amsterdam：Elsevier/Academic Press，2011.
[2] 侯红琴，谭志琼，张振臣.烟草花叶病毒属研究新进展[J].中国农学通报第，2008，24（5）：304-307.
[3] 许清孝.烟草花叶病毒的检测方法研究进展[J].现代农业科技，2013（11）：128-132.
[4] 钱 路，安榆林.物种鉴定的新武器-基因条码[J].植物检疫，2009（3）：42-46.
[5] HEBERT P D，CYWINSKA A，BALL S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings： Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.
[6] HEBERT P D，RATNASINGHAM S， DEWAARD J R. Barcoding animal life： cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings： Biological Sciences，2003（270）： 96-99.
[7] 張 宇.真菌DNA条形码研究进展[J].菌物学报，2012，31（6）：809-820.
[8] 罗朝鹏，杨 军，金立峰，等.烟草花叶病毒病的分子鉴定[J].烟草科技，2010（7）：58-61.
[9] 郭京泽，刘 鹏，崔铁军，等.辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒检测[J].检验检疫科学，2007，17（6）：32-34.
[10] 欧阳小艳，莫帮辉，余华丽，等.DNA条形码识别-DNA条形码与DNA芯片识别蚊媒准确性的比较[J].中国国境卫生检疫杂志，2007，30（6）：349-352.
[11] 范京安，顾海丰，陈世界，等.DNA条形码识别Ⅵ-基于微型DNA条形码的果实蝇物种鉴定[J].应用与环境生物学报，2009，15（2）：215-219.