摘 要：对赤霉素和脱落酸前体物质类胡萝卜素的关系进行了分析和探讨，发现二者之间存在着密切的联系，尤其是类胡萝卜素代谢途径的上游基因对赤霉素合成有很大影响。此外，全面深入的了解赤霉素的性质、生物学效应等，有利于我们更好地理解它如何在植物生长发育中发挥作用，从而改善其应用效果。
关键词：赤霉素；生物合成；类胡萝卜素；生物学效应
中图分类号：Q945 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.05.008
Influence of Carotenoids Metabolic Pathway Upstream Genes to Gibberellic Acid Biosynthesis and Its Molecular Biology Effect
YANG Hai-lan，JI Jing，WANG Gang，GUAN Chun-feng
（College of Agricultural,Tianjin University,Tianjin 300072,China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ: The relations between gibberellic acid and carotenoids (precursor substances of abscisic acid) were studied and discussed in this paper, and we found that they had strong relationships, especially the upstream genes in carotenoids metabolic pathways, which had a very great effect on gibberellic acid synthesis. In addition, as comprehensive deep learing on the nature of gibberellic acid and it’s biological effect, we can better understand the role that it plays in the plant development, and to improve its application value as well.
Key words: gibberellic acid；biosynthesis；carotenoids；biological effect
植物激素是植物自身合成的痕量生长调节分子的总称。植物体内有七大类激素，包括赤霉素、脱落酸、乙烯、生长素、细胞分裂素、油菜树甾醇和最新发现的独角金内酯, 类胡萝卜素是脱落酸的前体物质，它和赤霉素对调节植物体生长发育发挥着极其重要的作用。对其二者间相互关系的研究有利于更加清楚地了解植物各种生理活动的机理，掌握其规律，让其更好地为我们所用。
赤霉素是一种高效能的广谱植物生长调节剂。在20世纪70年代初中国就已经实现了赤霉素的产业化生产，并在农业生产上得到了广泛应用。利用农作物本身的赤霉素合成和信号转导缺陷所产生的矮化植株来培育抗倒伏农作物新品种，从而大幅度提高了农作物的产量，这就是农业生产上第一次“绿色革命”[1]。所以，对赤霉素的利用有很大的发掘潜力。类胡萝卜素通常是指C40的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物（叶黄素）两类色素的总称。在植物中，类胡萝卜素担当叶绿体光合作用的辅助色素并保护叶绿素免受强光破坏[2]。在人和其它动物体内，一些类胡萝素（α-类胡萝卜素，β-类胡萝卜素，β-隐黄质）是维生素A的前体物质，称为维生素A原，是防止维生素缺乏的重要营养物质。每年维生素A缺乏症导致25万～50万的儿童失明，其中一半人数死于维生素A缺乏的相关疾病。此外，类胡萝卜素还有清除自由基、延缓衰老、增强机体免疫力、预防癌症等重要作用[3]。
类胡萝卜素的代谢途径上游基因对赤霉素的合成有一定的影响，通过这一特点我们来认识、研究二者的关系。此外，通过对赤霉素的合成、信号调控、理化性质、植物中检测等方面，了解其分子生物学效应。
1 类胡萝卜素与赤霉素的关系
首先，在合成上，类胡萝卜素和赤霉素有共同的上游途径（图1）。类胡萝卜素是由5碳化合物异戊基二磷酸( IPP)构成。通过葡萄糖1-13C标记实验，在较高等植物中发现IPP存在两条合成途径。赤霉素及叶绿素相关的类异戊二烯（β-胡萝卜素，叶黄素，叶绿素和9-质体醌的戊烯链等），主要是通过一种MEP途径（甘油磷酸盐/丙酮酸途径）合成的，这最早发现于真菌和绿藻中。在细胞质中主要是MVA（乙酸/甲羟戊酸）途径合成IPP，它在合成菜油甾醇上有重要作用。而研究表明，在MVA受到限制的条件下，MEP途径也可以促进GA和类胡萝卜素的合成[4-5]。
Blanc 和Pichersky[6]首先克隆了IPP异构酶（IPPI）的cDNA。IPPI 催化IPP 形成DMAPP，推测IPPI 也可能是植物类胡萝卜素合成的限制因素。在高等植物中, GGDPS是一种多功能异戊烯转移酶,可催化GGP,FPP及GGPP的合成反应。它可通过亲和层析从红椒果实的叶绿体中分离出来。该酶的基因( GGDP) 也已被克隆得到。GGPS 是萜类物质合成的一个重要分支点酶。
类胡萝卜素在植物的许多生理过程中具有重要作用，八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS3）在类胡萝卜素合成过程中编码其中一个重要的酶。有人通过对矮化植物的研究，发现PDS3基因的表达影响到20个代谢途径，其中包括赤霉素的生物合成途径[7]。虾青素是一种红色的类胡萝卜素，在体内可与蛋白质结合而呈青、蓝色，有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病作用。Yandu Lu等人对雨生红球藻进行研究，发现其中赤霉素诱导虾青素的合成,与β-胡萝卜素酮化酶（ketolase）基因（bkts）转录的上游调控密切相关。经过实验分析，赤霉素中一类GA3的处理促进了β-胡萝卜素ketolase基因的转录。在bkt 5＇-侧翼区发现存在赤霉素应答顺式作用元件，这表明赤霉素构成虾青素合成网络的信号[8]。从这些研究中我们可以看出，赤霉素和类胡萝卜素在合成途径上相互影响，相互调节，共同在植物的生长发育过程中发挥作用，对于它们如何在环境变化中进行调节还需进一步的研究。
2 GA的理化性质及其作用
至今，人们已发现一百多种赤霉素，按其发现的顺序命名为：GA1，GA2，GA3……它们的基本结构是20C的赤霉烷，它是由4个异戊二烯单位组成，含有4个碳环的双萜类物质。GA3是最早被分离出来的赤霉素，其性质具有一定的代表性。赤霉素GA3能很好地溶解于醇类(如甲醇、乙醇)、丙酮、醋酸乙酯、冰乙酸等有机溶剂和磷酸盐缓冲溶液中。微溶于水、醚中，不溶于石油醚、苯、氯仿等溶液中。在温度较低的酸性条件下，比较稳定。赤霉素GA3不能以水溶液的形式在室温下长期保存。GA3与硫酸作用，生成荧光物质，在紫外线激发下呈现蓝绿色荧光，在一定的浓度范围内，GA3的浓度与产生荧光强度成正比，因此，我们可以根据这一特性，运用荧光法来测定其含量[9]。
高等植物中的赤霉素主要存在于幼根、幼叶、幼嫩种子和果实等部位，在植物体内运输时无极性，通常由木质部向上运输，由韧皮部向下或双向运输。赤霉素最显著的效应是促进植物茎的伸长。赤霉素的生物学效应主要是：增加植物细胞分裂，促进木聚糖的合成，促使植物细胞伸长。
近年来，许多学者对其作用进行了研究，笔者以玉米为例进行了总结：（1）在种子吸胀、萌动阶段, GA3 能明显促进种子吸水和加快种子萌动， Ca2+ 则表现出延缓种子吸水和萌动; GA3 和Ca2+ 能显著提高玉米种子的发芽势和简化活力指数， 且表现出一定的加成作用，但对种子发芽率没有影响; GA3 能显著促进玉米种子根的生长, Ca2+ 对玉米芽的生长有显著的促进作用[10]。（2）赤霉素能促进种子发芽和幼苗的生长[11]；（3）赤霉素能促进雄穗的发育提前抽雄，浓度大时会致使雄穗发育不完全或败育。杂交时用于促进花期相遇[12]。（4）与玉米的杂种优势有关。外源GA3促进全部基因型的苗高，其中自交系最敏感，还使势能比降低， 因而降低了杂种优势[13]。（5）氯乙烯醇(PVA)与赤霉素(GA)混合处理玉米种子对其萌发、代谢、生长及产量有影响。 这一处理方法能明显提高种子活力，促进萌发，加快萌发代谢,增强抗旱性[14]。
3 赤霉素的合成途径
GA生物合成中需要多种酶的参与，如古巴焦磷酸合成酶(CPS)、内根-贝壳杉烯合成酶(KS)、内根-贝壳杉烯19-氧化酶(EKO)、内根坝壳杉烯酸7β羟化酶、GA12-醛合成酶、GA-7-氧化酶(GA7ox)、GA13-羟化酶(GA13ox)、GA20-氧化酶(GA20ox)、GA3β羟化(GA3βox)和GA2-氧化酶(GA2ox)等（15）。合成共分为3个阶段[16]。首先，GGPS经CPS催化形成CPP，接着由KS将其环化。其中，CPS对GA的合成起着重要的作用。Ent-kaurene的C-19甲基被KO多次氧化分别形成Ent-kaurenol、Ent-kaurenal、Ent-kaurenoic acid，这是赤霉素合成的第一阶段，在质体中完成。第二阶段主要是在内质网的膜上进行，由ent-kaurene在KO和KAO的作用下生成GA12-7-醛，这也是GA的最初产物。据研究，GA12-7-醛可能是所有GA的前体，赤霉菌和高等植物前两个阶段合成过程是共有的。二者存在的一个区别是，前者的ent-kaurene合成有CPS和KS两个酶分别催化，在赤霉菌中，是由单一的CPS/KS双功能酶直接催化的。
在第三阶段，由于不同的酶和底物作用形成许多不同的产物，在植物和真菌中也存在明显区别。在植物中，该阶段分为3条途径：（1）早期的3-β羟基化途径，发生在最后一步反应中，由双加氧化酶催化，由于它具有多功能性，植物体内发生多种不同的反应，不同赤霉素结构的形成根据植物种类或植物组织不同而有所差异，而在赤霉菌中发生在信号通路的早期，有细胞色素P450单加氧化酶催化；（2）早期的13-β羟基化途径；（3）早期的非3，13-羟基化途径。GA20x是这一阶段中非常关键的酶，因为它的底物专一性不强，对底物的亲和力与C-13位是否羟基化有关。
要更好地利用赤霉素，那么了解它的合成途径也是非常必要的。虽然现在有很多关键酶的基因已经克隆出来，并且对途径过程中调控也有很多学者进行了研究，但是，仍然存在许多问题未解决。
4 赤霉素在植物中的分析及检测
目前赤霉素的测定方法有很多种，主要有两类[17]：一为生物法，如免疫法。其准确度高，但是较复杂。二是理化测定法，如荧光比色法、气相和液相色谱法等。
免疫法是一种取样少， 灵敏度高的检测法。最初建立的赤霉素免疫测定法灵敏度低，不能对生理水平的GA进行定量测定[18]。之后建立了GAs放射免疫测定法(R1A) ，其取样少，精度高，操作简便，但是仍存在一些缺点，如有污染，费用高。1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELJISA分为直接法和间接法。黄少白、周燮等人将卵清蛋白(OVA)与GA4的复合物用于包板， 最早建立了GA 1，4 ，7间接ELlSA。荧光法是GA测定的经典方法，但该法操作过繁，试剂消耗量大，且需要真空泵及冰浴等条件[17]。所以一般用于发酵法产赤霉素的测定。使用高效液相色谱(HPLC)对蔬菜中的农药GA残留进行分析检测。用80％ 甲醇溶液作为提取剂；建立了液液萃取与SPE—PAK CI 8固相萃取相结合纯化GA3的方法；检测波长为206．00 nm，流动相为甲醇与7.5 mmol·L-1 甲酸水的体积比为3∶7的溶液；实验结果表明，该方法是符合快速、可靠、灵敏、实用标准的GA，残留分析检测方法[19]。王骏等人运用液相色谱-质谱法测定猕猴桃中赤霉素的含量，并证明该方法操作简单，灵敏度高。
赤霉素作为植物的一类重要激素，值得我们对其更深的探索，希望通过对其研究改进，能让它为人类带来更大的益处。
参考文献：
[1] 谈心,马欣荣.赤霉素生物合成途径及其相关研究进展[J].应用与环境生物学报，2008，14(4)：571-577.
[2] 侯耀兵,康保珊,黄进勇.植物类胡萝卜素研究进展[J].中国瓜菜，2009（4）：28-31.
[3] 任永霞,王罡,郭郁频,等. 类胡萝卜素概述[J].山东农业大学学报，2005,36(3):485-488.
[4] Hartmut K L, J?觟rg S, Andrea D，et al. Biosynthesis of isoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via a mevalonate-independent pathway[J].Febs Letters，1997,400 : 271.
[5] Kasahara H, Hanada A, Kuzuyama T, et al. Contribution of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to the biosynthesis of gibberellins in Arabidopsis[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(47): 45188-45194.
[6] Blanc V M, Pichersky E. Nucleotide sequence of a Clarkia breweri cDNA clone of Ipi1, a gene encoding isopentenyl pyrophosphate isomerase[J]. Plant Physio,1995, 108（2）： 855-856.
[7] Qin G J,Gu H Y,Ma L G, et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid,and gibberellin biosynthesis[J]. Cell Research,2007.
[8] LU Y D,JIANG P,LIU S F, et al. Methyl jasmonate- or gibberellins A3-induced astaxanthin accumulation is associated with up-regulation of transcription of β-carotene ketolase genes (bkts)in microalga Haematococcus pluvialis[J].Bioresource Technology，2010,101：6468-6474.
[9] 胡先明，何建社.赤霉素GA3（920）理化性质与提取方法[J].适用技术市场，1990（11）：9-10.
[10] 陈士林，卫秀英，赵新亮.赤霉素和钙对玉米种子萌发的效应[J].种子,2004,23(4):47-49.
[11] 赵文志，李会珍，张志军，等.生物种衣剂与赤霉素互作对玉米种子发芽及幼苗生长的影响[J].种子世界，2006（8）：29-30.
[12] 吴凤国，徐洪刚，刘艳红.赤霉素调节制种玉米花期[J].农药，2010（4）：47.
[13] Rood S B，张庆江，籍贵苏.赤霉素与玉米杂种优势：数量关系[J].河北农作物研究，1992（2）：52-55.
[14] 王旭明，洪法水，马成仓.聚乙烯醇与赤霉素混合处理对玉米生长及产量的影响[J].安徽农业科学，1997，25(2)：153-155.
[15] Yu H F，Cao J S，Wang Y Q ．Hormones regulation in plant dwarfing mutants[J]．Chin Bull Life Sci，2002，14(2)：85-88.
[16] 黄先忠，蒋才富，寥立力，等.赤霉素作用机理的分子基础与调控模式研究进展[J].植物学通报，2006，23（5）：499-510.
[17] 薛泉宏，李东，汤莉.赤霉素荧光测定法改进研究[J].西北农业大学学报，2000,28(4):34-39.
[18] 黄少白，周燮.GA 1，3，4，7 酶联免疫检测法(ELISA)的建立[J].华北农学报，1993(4)：46-51.
[19] 葛雅琨 ，张元新 ，胡睿 ，等.蔬菜中赤霉素残留量的高效液相色谱检测方法研究[J].吉林化工学院学报，2005,
22(2):13-16.
收稿日期：2011-04-08；修订日期：2011-07-04
基金项目：国家“十一五”重大专项转基因生物新品种培养重大专项(2009ZX08003-019B)、(2008ZX08003-005)、(2008ZX08004-001)、(2009ZX08010-013B)
作者简介：杨海兰（1986-），女，天津人，在读硕士生，主要从事玉米遗传育种研究。通讯作者为季静。