[摘要] 目的 从血液流变学和红细胞膜生物学变化探讨气滞血瘀证在红细胞膜上的生物学差异。 方法 20只Wistar大鼠，随机分为空白组及气滞血瘀组，每组10只。采用声光电等复合刺激对气滞血瘀组连续造模15 d后，取血测定血液流变学指标以及红细胞膜组分相关指标。 结果 与空白组比较，气滞血瘀组大鼠体重显著降低；全血黏度、血浆黏度和红细胞变形指数都有降低趋势但无显著性；APTT降低极显著（P < 0.01）；PT、FIB和TT无显著变化；Na+-K+-ATP酶活力及SOD活力均显著降低（P < 0.01，P < 0.05）；唾液酸含量显著降低（P < 0.05）；MDA含量显著升高（P < 0.05）。 结论 气滞血瘀模型中红细胞膜上Na+-K+-ATP酶及SOD酶活力降低，并且唾液酸含量降低，但是全血黏度及红细胞变形性等未发生显著变化，但都有相应的趋势出现，可能是本实验中刺激强度较大但刺激时间略短造成的，也有可能和APTT等凝血机制有关，此模型有待进一步探索。
[关键词] 气滞血瘀；血液流变学；红细胞膜；生物学差异；血瘀证
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0006-03
血瘀证是许多复杂性重大疾病过程中的常见证候，也是中西医结合研究最为活跃的领域之一。从20世纪60年代开始，中医药工作者就开始了血瘀证及活血化瘀治法的研究，随着科学技术的不断进步，人们对疾病的认识更加深入，有关血瘀证及活血化瘀治法的研究也不断深入，相关研究更加活跃[1]。本文从气滞血瘀这种公认的血瘀证动物模型入手，借助已建立的红细胞膜生物学特征研究平台，探求气滞血瘀证在红细胞膜上的生物学差异。今后将为方药活血化瘀机制的研究提供参考价值。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级Wistar老龄大鼠20只（15～17周龄），雌雄各半，体重 （263.0±12.9） g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（黑）2008004）。
1.2 仪器
Anthos2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司），BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD 2000（美国Alltech公司）。
1.3 试剂
甲醇（色谱纯，美国迪马技术有限公司），甲醇（分析纯，西陇化工股份有限公司），氯仿（分析纯，天津市化学试剂六厂分厂），胆固醇对照品（美国Sigma公司）。
1.4 方法
1.4.1 分组及模型的复制
20只Wistar大鼠随机分为2组，即气滞血瘀组和空白组，气滞血瘀组每天采用声光电复合刺激加钳尾方法复制血瘀模型，模拟气滞血瘀证[2-5]。将10只大鼠正式造模前1 d禁食不禁水，采用不可预知的慢性应激刺激方法进行干预，包括大鼠足底电击刺激10～12 h（电压在25～ 35 V，持续时间为60～120 s，每间隔8～ 15 分钟给予刺激1次）；噪声刺激10～12 h（噪音频率为5～15 KHz；强度等级为3；持续时间为60～120 s，每间隔8～15分钟给予刺激1次）；闪烁光刺激（频率为1～3 Hz；持续时间为60～120 s，每间隔8～15分钟给予刺激1次）。24 h光照与黑暗刺激（将大鼠日夜颠倒饲养，白天12 h置于暗室中；夜晚12 h置于日光灯下饲养）以及夹尾刺激10～12 h （以钳子夹大鼠的尾根至尾尖处，持续时间为60～120 s。每间隔8～15分钟给予刺激1次）。以上方法每5天为一个周期，不重复使用。如此连续操作15 d。末次造模后禁食不禁水12 h。次日以乌拉坦1 g/kg麻醉，固定，取血进行指标的测定。
1.4.2 红细胞膜的制备
取新鲜肝素抗凝血2 mL以及枸橼酸钠抗凝血6 mL。其中枸橼酸钠抗凝血以3000 r/min离心10 min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小板层，再以1∶3比例加入等渗pH 7.4 PBS，3000 r/min离心10 min，弃上清液，反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1∶80比例向红细胞中加入预冷的5 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl溶液[6]，同时加入0.1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲苯磺酰氟），超声15 min（80 Hz，20 ℃），放入4 ℃冰箱过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以15000 r/min离心10 min，弃上清液，加入5 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl溶液以15000 r/min离心10 min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜，将其1∶1悬浮在PBS溶液中，膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。
1.4.3 观察指标及测定
1.4.3.1 表征观察及体重变化 观察大鼠造模前后外观表征、活动等状态；测定造模前后大鼠体重变化。
1.4.3.2 血液流变学指标测定 全血黏度、血浆黏度及红细胞变形性采用相应仪器测定；全自动生化分析仪对血浆CHO（胆固醇）、TG（甘油三酯）测定；FIB、PT、TT和APTT按照试剂盒说明书测定。
1.4.3.3 红细胞膜组分变化 红细胞膜唾液酸、巯基含量、Na+-K+-ATP酶活性、SOD及MDA水平测定根据试剂盒说明书进行测定；红细胞膜胆固醇含量采用HPLC法测定。
1.5 统计学处理
统计学方法采用SPSS 16.0软件处理所得数据，选用One-way ANOVA进行统计分析，数据以x±s表示。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模前后大鼠动物表征观察及体重变化
2.1.1 造模前后大鼠动物表征观察
造模前，两组大鼠均活动正常，反应灵敏；毛色浓密有光泽；鼠尾温度正常。造模2周后气滞血瘀组大鼠体重稍有下降趋势。毛暗淡无光，易脱落。眼球突出，磨牙次数增多，脸部扭曲变形，腮部呈不规则凹陷或突出，易颤。鼠尾出现不同程度的瘀斑。反应灵敏，对外界刺激敏感，好斗、暴躁、易怒、易受惊。大小便失禁，便溏。
2.1.2 造模前后大鼠体重变化情况
与空白组比较，造模前大鼠体重无明显差异；造模1周后，气滞血瘀组大鼠体重有下降趋势，但无显著差异；造模2周后，模型组大鼠体重明显下降（P < 0.01）。见表1。
2.2 血液流变学指标测定结果
2.2.1 全血黏度及血浆黏度测定结果
与空白组比较，全血黏度、血浆黏度以及红细胞变形指数无显著变化，但有下降的趋势（P > 0.05）。见表2。
2.2.2 血脂含量及凝血4项的测定结果
与空白组比较，血浆胆固醇和甘油三酯无显著变化；对APTT降低显著（P < 0.01）；对PT、FIB和TT无显著影响。见表3。
2.2.3 红细胞膜组分变化结果
与空白组比较，气滞血瘀组Na+-K+-ATP酶活力及SOD活力均显著降低（P < 0.01，P < 0.05）；唾液酸含量显著降低（P﹤0.05）；MDA含量显著升高（P﹤0.05）。见表4。
3 讨论
喜怒忧思悲恐惊是人体受到外界刺激之后正常的情志反应，但若情志过激、过久、过量则会对机体产生不良影响，甚至导致疾病。早在《素问·举痛论》中就有“怒则气上，喜则气缓，悲则气消，恐则气下……惊则气乱……思则气结”的记载。现代医学研究认为，不良情绪刺激可直接影响中枢神经系统而造成血管痉挛，引起血液循环障碍[7]。其中发怒可使交感神经兴奋，儿茶酚胺大量释放，表现为心跳加速，呼吸加快，血压升高，血管（脑血管、冠脉）痉挛，血流加快，红细胞增多等[8]。由此可见，中医有关忧思郁结、愤懑恼怒等情志所伤，使气机不畅甚或郁滞而致血行迟滞而成瘀的这一观点有其现代医学的诠释。
本实验中参考文献方法，应用不可预见的声、光、电复合刺激模拟慢性应激性刺激，以钳尾激惹造成大鼠愤怒、惊恐，两种方法相结合以最大限度模拟中医七情所伤而气滞血瘀[9-12]。随着造模时间的延长，动物普遍出现对外界刺激敏感、好斗、易激惹、易怒、易惊的情绪变化，外观上表现出眼球突出，磨牙次数增多，面部扭曲变形等表现，大鼠尾部出现瘀斑，说明表征上具备血瘀表现。造模2周后，取血测得该组全血黏度、血浆黏度、红细胞变形性等与空白组比较虽然没有明显差异，但Na+-K+-ATP酶、SOD活力、唾液酸含量均显著降低，MDA含量显著升高，并且APTT降低明显（P < 0.01）。唾液酸是红细胞膜表面负电荷的主要来源，气滞血瘀大鼠红细胞膜唾液酸含量减少，其所带负电荷就减少，则红细胞聚集性增加，并伴随血液黏度的升高，可以加速红细胞老化，使红细胞寿命缩短，凝聚性及膜的脆性增加，从而导致血液流变性改变；而气滞血瘀大鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性降低，红细胞内将失K+量增加，水分亦随Na+进入细胞内，这样可使红细胞体积增大而变成球形甚至水肿破裂，红细胞的变形性下降；红细胞膜上SOD活力降低反映机体清除氧自由基的能力低下。因此气滞血瘀大鼠红细胞膜上这些指标的变化从不同角度阐述了红细胞变形性降低的机制。本实验结果与文献有出入，原因可能是本实验中施以大鼠的刺激强度虽大而刺激时间略短造成的。而APTT明显变化以及分子流变学指标中的差异处提示下一步实验应适当延长造模时间，并应该同时考虑除红细胞以外的因素在该模型中的贡献度，鉴于课题研究时限，这些探讨将在今后的研究中开展。
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（收稿日期：2013-03-04 本文编辑：魏玉坡）