[摘要] 目的 探讨维生素D对糖尿病肾病大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）和重组人胶原蛋白-1（collagen-1）表达的影响，进一步探讨以上3个基因在糖尿病肾病中相互作用以及维生素D对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用。 方法 将54只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组（18只）、模型组（18只）、治疗组（18只）。其中，模型组及治疗组大鼠均行糖尿病肾病造模，饲以高脂高糖饲料6周，空腹12 h后给予小剂量链腺佐菌素腹腔注射。注射1周后，不同日期测随机血糖（GLU）3次，若3次GLU均≥16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠。2型糖尿病成模后的大鼠在6周和7周时用尿微量蛋白试纸连续测大鼠晨尿3次以上，若为阳性，则为2型糖尿病肾病的大鼠。治疗组给予骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/（kg·d）灌胃37 d，模型组给予花生油灌胃37 d。处死大鼠，取肾脏，采用HE、电镜技术观测肾脏组织的形态学变化，采用实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）评价肾脏TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表达的变化。 结果 ①模型组TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表达高于正常对照组（P < 0.05），治疗组TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表达明显低于模型组（P < 0.05）。② 采用HE、电镜技术可以看出治疗组病理组织形态学，尤其是组织结构完整性明显优于模型组。 结论 糖尿病肾病大鼠中，维生素D可以通过下调TGF-β1、collagen-1及CTGF基因的表达，对糖尿病肾病起保护作用。
[关键词] 糖尿病肾病；维生素D；转化生长因子1；结缔组织生长因子；重组人胶原蛋白-1
[中图分类号] R587.1[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（b）-0008-05
Effect of vitamin D on the expression of growth factor growth factor beta 1, recombinant human collagen-1 and connective tissue growth factor in kidney of rats with type 2 diabetic nephropathy
TIAN Yanyan YANG Ye ZHANG Yuanyuan YU Rui Xiaolati·Yimamuming ZHU Jia ZHU Jun▲
Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumchi 830000, China
[Abstract] Objective To explore the effect of vitamin D on the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), connective tissue growth factor (CTGF) and restructuring of collagen-1 (collagen-1) in diabetic nephropathy rat, discuss their interaction in diabetic nephropathy, and the protective effect of vitamin D for the kidney of diabetic nephropathy rat. Methods 54 male SD rats were randomly divided into three groups: normal control group (n=18), model group (n=18), treatment group (n=18). The model group and treatment group rats were established diabetic nephropathy model, and fed with high fat diet for 6 weeks, then intraperitoneal injection of small dose streptozotocin after fasting for 12 hours. 1 week after injection, 3 times of blood glucose (GLU) on a different date were measured, if 3 times of GLU all ≥16.7 mmol/L indicated that rats had type 2 diabetes mellitus. 6 and 7 weeks after type 2 diabetes mellitus model establishment, trace protein urine dipstick was used for detection of the morning urine of rats for at least 3 times, if the results were positive, indicated that rats had type 2 diabetic nephropathy. The treatment group was given 0.03 μg/(kg·d) calcitriol dissolved in 0.05 mL peanut oil by intragastric administration for 37 d. The model group was given peanut oil by intragastric administration for 37 d. After treatment all rats were killed, and the kidneys were removed. HE, electron microscopy were used for morphological changes observation of renal tissue, real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR) was used for evaluation of expression changes of renal TGF-β1, collagen-1 and CTGF genes. Results ①The expression of TGF-β1, collagen-1 and CTGF genes in the model group were significantly higher than those in the normal control group (P < 0.05), which in the treatment group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). ②The results of HE, electron microscopy showed that in the treatment group the pathological tissue morphology, especially organizational structure integrity was better than that of model group significantly. Conclusion Vitamin D can down regulate the expression of TGF- β1, collagen-1 and CTGF genes, has protective effect on diabetic nephropathy for the diabetic nephropathy rats.
[Key words] Diabetic nephropathy; Vitamin D; Transforming growth factor 1; Connective tissue growth factor; Recombinant human collage-1
糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，其主要的病理改变是毛细血管基底膜增厚及系膜基质增生，最终导致肾小球硬化。目前在欧美等发达国家位居终末期肾病病因的首位[1]，在我国也上升至终末期肾病病因的第2位，约占总终末期肾病的25%[2-3]，目前仍然处于上升的趋势。近年活性维生素D3（1，25-二羟维生素D3，骨化三醇）的肾脏保护作用受到关注，本研究通过观察活性维生素D3对糖尿病肾病（DN）模型大鼠肾脏病程进展的作用以及维生素D3对DN模型大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）和重组人胶原蛋白-1（collagen-1）表达的影响，进一步探讨维生素D3对相关基因在糖尿病肾病发生和发展中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 动物清洁级雄性SD大鼠54只（由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供），平均体重（280±10）g。动物生产和使用许可证号分别为：scxk（新）2011-0001和syxk（新）2011-0002。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会同意。
1.1.2 主要试剂链脲佐菌素（STZ，美国SIGMA），骨化三醇胶丸（上海罗氏制药有限公司，国药准字J201000 56，0.25 μg/粒），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体（美国abcam公司），兔抗大鼠CTGF多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗大鼠collagen-1多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），尿液分析试纸条（ARKRAY Factory，Japan），PCR试剂RNeasy Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany），QuantiTect Rev. Transcription Kit（Qiagen，Hilden，Germany），QuantiFast SYBR green PCR Master Mix （Qiagen，Hilden，Germany），多重实时荧光定量PCR（Bio-rad，IQ5，USA）。
1.2 方法
1.2.1 分组、建模及标本收集将54只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组（18只）、模型组（18只）、治疗组（18只）。模型建立：正常对照组饲以普通饲料喂养，模型组及治疗组，饲以高脂高糖饲料6周（饲料配方：10%炼猪油，20%蔗糖，2%胆固醇，8%蛋黄粉，60%普通饲料），大鼠空腹12 h后给予小剂量STZ（30 mg/kg溶入pH为4.5的柠檬酸缓冲液）腹腔注射。注射1周后，测随机血糖，若血糖值≥16.7 mmol/L者为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠；若血糖值≥1次未达标者测空腹血糖（FPG）和葡萄糖耐量实验2 h血糖（2 h PG，葡萄糖耐量实验：实验前禁食12 h，空腹剪尾取血测FPG，继以葡萄糖2 g/kg灌胃，于120 min 时取血测血糖），取FPG≥7.0 mmol/L和（或）2 h PG≥11.1 mmoI/L者为2型糖尿病大鼠。2型糖尿病成模大鼠在STZ注射后6周和7周时用尿微量蛋白试纸连续测晨尿3次以上，若为阳性，则为2型糖尿病肾病的大鼠。2型糖尿病肾病建模成功后，治疗组给予骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/（kg·d）灌胃37 d，模型组给予等量花生油灌胃37 d，正常对照组不做任何处理。37 d后统一处死，留取大鼠肾脏，分别取组织切片（各尺寸均小于0.5 cm）在室温下浸入约5倍体积的RNAlater液中，然后将样品于-20°C保存；在肾皮质处切取1 mm×1 mm×1 mm大小肾组织数块放入2.5%戊二醛固定；其余肾脏以4%多聚甲醛固定。
1.2.2 肾脏组织HE染色取新鲜肾脏组织用生理盐水冲洗干净，然后采用10%福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm石蜡切片，行HE染色。
1.2.3 电镜肾皮质处切取1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，采用戊二醛和锇酸双重固定，丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋，LEICAI UC6超薄切片机进行超薄切片，铅铀电子染色，JEOL1230透射电子显微镜观察。
1.2.4 Real-time PCR使用RNeasy Mini Kit提取未处理组和处理组组织中的总RNA，并按照QuantiTect Rev. Transcription Kit的操作说明，对提取出的总RNA进行反转录合成cDNA。扩增cDNA模板的Real-time PCR基因特异性的引物对见表1。使用包含ROX校正染料的QuantiFast SYBR green PCR Master Mix进行定量PCR反应。定量PCR扩增条件：第一步95℃，5 min；第二步95℃，10 s，60℃ 30 s，40个循环。结果判断：采用相对定量的方法，用内参基因β-actin的表达对结果进行标准化。基因β-actin和TGF-β1的PCR扩增效率用梯度稀释cDNA模板生成的标准曲线进行检测。所有的实验均进行3次重复，通过溶解曲线对PCR反应产物的质量进行控制。TGF-β1的相对表达量通过ΔΔCt方法进行计算：△Ct糖尿病肾病=Ct糖尿病肾病TGF-β1-Ct糖尿病肾病β-actin，△Ct正常= Ct正常TGF-β1-Ct正常样β-actin，△△Ct = △Ct糖尿病肾病- △Ct正常，TGF-β1在糖尿病肾病样本和正常样本中的相对表达差异用2-ΔΔCt计算。基因CTGF、collagen-1表达量均采用以上方法计算。
表1 Real-time PCR基因特异性的引物对
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾脏光镜改变
正常对照组可以看到肾小球毛细血管网与囊壁无粘连，有完整囊壁结构，毛细血管网无闭塞现象，肾小管结构基本正常。模型组与正常对照组相比，系膜细胞增生明显，肾小球毛细血管网与囊壁有粘连现象，无囊壁结构，毛细血管网无闭塞现象。治疗组与模型组相比，系膜细胞稍有增生，肾小管扩张不明显，炎症细胞浸润少，毛细血管网与囊壁无粘连，囊壁结构完整，毛细血管网无闭塞现象。见图1。
2.2 肾脏电镜改变
正常对照组肾小管上皮细胞细胞核形态规整，核圆，线粒体丰富，结构正常，呈椭圆形，可见少量溶酶体，微绒毛排列整齐，肾小管基膜光滑。模型组肾小管基底膜皱缩可见大量丘状隆起，小管间毛细血管肿胀明显，局部出现肾小管上皮细胞空泡变，可见坏死脱落。治疗组肾小管结构基本正常，线粒体丰富，上皮细胞较正常，有质膜间隙增宽，基底膜基本光滑。通过电镜观察不难看出，模型组肾脏结构的病理变化明显，结构不完整，局部可见到明显的坏死脱落，治疗组肾小管、肾小球结构较模型组相比基本正常。见图2。
图2 各组肾小管及肾小球的电镜观察（6000×）
2.3 各组CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表达情况
模型组CTGF、TGF-β1、collagen-1基因的表达量明显高于正常对照组（P < 0.05）；治疗组CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表达量低于模型组（P < 0.05）。见表2、图3~5。
与正常对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05
图3 各组肾脏组织CTGF基因表达变化
与正常对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05
图4 各组肾脏组织TGF-β1基因表达变化
与正常对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05
图5 各组肾脏组织collagen-1基因表达变化
表2 各组CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表达情况（x±s）
注：与正常对照组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；TGF-β1：转化生长因子β1；collagen-1：重组人胶原蛋白-1；CTGF：结缔组织生长因子
3 讨论
TGF-β1是一种广泛分布于多种细胞组织中的多肽类调控蛋白，在肾小球硬化和肾小管间质纤维化发生、发展中起作用，被认为是诱导肾小管间质纤维化的重要细胞因子之一[4-5]。肾小管间质纤维化以过量细胞外基质在正常肾小管和肾间质聚集为特征，被认为是各种不同病因所致慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同病理途径。肾小管间质纤维化的早期防治对肾脏疾病转归有重要意义[6]。
CTGF是抗纤维化作用因子之一，是一种富含半胱氨酸的多肽[7]。Bradham等[8]于1991年首次发现了这种细胞因子。据研究，在生理状态时，肾间质内有少量CTGF，在某些病理状态下，CTGF表达量显著增加。动物实验也表明，各种纤维化疾病模型中，CTGF的表达都显著升高[9]。CTGF生物学效应较为单一，因此阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种预防纤维化的有效手段[10-12]。
近年来维生素D，尤其是其活性代谢产物活性维生素D[1，25-（OH）2D3]对糖尿病肾病的肾脏保护作用备受关注。有研究表明，维生素D主要是减少肾脏足细胞肥大及丢失，进而减轻蛋白尿及肾小球硬化[13]，抑制高糖诱导的血管紧张素原和肾素表达，继而抑制细胞外基质的沉积，抑制白细胞介素（IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α等递质的作用，抑制TGF-β1、NF-κB、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1等细胞因子的表达，抑制巨噬细胞浸润等，抑制炎症因子分泌，抑制系膜细胞增殖和保护足细胞等活性，对糖尿病大鼠肾脏损伤有预防保护作用[14]。
在本研究中可以发现，TGF-β1、CTGF、collagen-1在治疗组中的基因表达量高于空白组，低于模型组（P < 0.05），提示糖尿病肾病大鼠的肾脏损伤可能与TGF-β1、CTGF、collagen-1相关。给予维生素D干预后，治疗组的TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表达量明显低于模型组，提示维生素D可能通过下调TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表达来发挥肾脏的保护作用。Tall等[15]的研究结果提示，CTGF可以被TGF-β1诱导表达，并作为TGF-β1主要的下游介质介导其促纤维化作用。然而CTGF既可以被TGF-β1调节，同时又是TGF-β1的调节者。
通过光镜不难看出，模型组与正常对照组相比存在更严重的肾小球硬化，表现为肾小球系膜区更多的细胞外基质集聚，相比之下，治疗组细胞外基质集聚的量远小于模型组。电镜下可见到模型组肾脏结构的病理变化明显，结构不完整，局部可见到明显的坏死脱落，治疗组可以发现肾小管、肾小球结构较模型组相比明显好转。进一步验证了维生素D对糖尿病肾病的治疗效果比较显著。目前维生素D对糖尿病肾病发展的作用尚没有报道，在后期的工作中可以以这点作为方向进一步研究维生素D对糖尿病肾病发展的具体作用，为临床工作打下坚实的基础。
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（收稿日期：2014-03-03本文编辑：程铭）
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（编号81160116）。
[作者简介] 田燕燕（1965.6-），女，新疆乌鲁木齐人，新疆医科大学2011级内分泌专业在读硕士研究生；研究方向：内分泌与基础代谢。
[通讯作者] 朱筠（1966.7-），女，新疆乌鲁木齐人，新疆医科大学第一附属医院内分泌科主任；研究方向：内分泌基础研究。